除草劑草甘膦微生物降解技術(shù)研究進(jìn)展

王軍華+王易芬+陳蕾蕾+周慶新+杜方嶺

摘要：草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑品種之一，造成日益嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)危害，并隨著食物鏈在哺乳動(dòng)物體內(nèi)富集，進(jìn)而危害人類(lèi)健康；微生物降解是清除環(huán)境中草甘膦的最主要途徑，是降低草甘膦危害的一種有效方法。對(duì)近幾年篩選得到的草甘膦高效降解菌、主要降解途徑和降解產(chǎn)物、草甘膦的原位修復(fù)研究進(jìn)行了總結(jié)，探討了微生物降解用于緩解草甘膦造成的環(huán)境污染的難題。

關(guān)鍵詞：草甘膦；微生物降解；降解途徑；原位修復(fù)

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.4；S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0008-04

草甘膦（glyphosate）是一種高效除草劑，被植物經(jīng)莖葉吸收后，通過(guò)抑制植株5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性來(lái)干擾5-烯醇式莽草酸-3-磷酸的合成，從而抑制植株合成芳香性氨基酸，最終導(dǎo)致植物葉片枯黃脫落，死亡[1-2]，可控制世界上絕大多數(shù)危害性雜草，成為全世界除草劑使用量最大的種類(lèi)之一[3]。

草甘膦由Monsanto公司開(kāi)發(fā)應(yīng)用以來(lái)，一直被認(rèn)為對(duì)非靶標(biāo)生物具有低毒性。對(duì)草甘膦及其制劑的研究顯示，草甘膦未在任何動(dòng)物的組織中富集，也未對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生危害[3]。然而40多年的應(yīng)用，尤其是1983年高抗草甘膦基因研發(fā)后[4]，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物被廣泛種植，引起的草甘膦大規(guī)模應(yīng)用，導(dǎo)致其在土壤中大量積累，已經(jīng)對(duì)土壤化學(xué)過(guò)程和生態(tài)系統(tǒng)造成影響，而且給環(huán)境帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)，威脅了人類(lèi)健康[5]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，土壤中殘留的草甘膦會(huì)破壞土壤微生態(tài)，影響微生物數(shù)量和土壤酶的活性，尤其會(huì)抑制放線(xiàn)菌數(shù)量和脲酶的活性[6-7]，而且殘留的草甘膦會(huì)隨地表徑流進(jìn)入地表水，影響水質(zhì)，造成水生生態(tài)的失衡[8-9]。不僅如此，更有研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦會(huì)影響孕期動(dòng)物的胚胎發(fā)育，導(dǎo)致形態(tài)異變[10-12]。例如，干擾海膽胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期[10]，增加非洲爪蛙的胚胎和雞胚變異的可能性[11]等。同時(shí)，Clair等對(duì)小鼠研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的草甘膦（約10 000 mg/kg）對(duì)小鼠睪丸的支持細(xì)胞有急性細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡；而低劑量的草甘膦（1 mg/kg，相當(dāng)于攝食草甘膦處理的玉米后，人尿液中草甘膦的含量），雖然沒(méi)有細(xì)胞毒性，但是會(huì)使睪丸酮的分泌降低35%，干擾睪丸的內(nèi)分泌[12]。Poulsen等還發(fā)現(xiàn)，草甘膦能夠穿透人類(lèi)胎盤(pán)障礙進(jìn)入胎兒室，影響胎兒正常發(fā)育[13]。由此可見(jiàn)，土壤中富集的草甘膦不僅對(duì)環(huán)境造成影響，破壞生態(tài)平衡，并能通過(guò)食物鏈的富集進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)而威脅人類(lèi)健康，草甘膦的安全問(wèn)題應(yīng)引起人們的足夠重視。

1 草甘膦的生物降解菌

土壤中的草甘膦易發(fā)生水解、光化學(xué)降解、生物降解等，而生物降解是草甘膦降解的最主要途徑[14-15]。在自然環(huán)境中，尤其是長(zhǎng)期施用草甘膦的土壤中，存在種類(lèi)繁多的能耐受或降解草甘膦的微生物菌群[16]，這有利于尋找高效降解菌，對(duì)緩解草甘膦造成的環(huán)境危害具有重要意義。

在純培養(yǎng)條件下，科學(xué)家們一直沒(méi)能分離出可利用草甘膦的細(xì)菌，直至1983年，Moore等篩選出假單胞菌PG2982，是能利用草甘膦作為唯一磷源的細(xì)菌[17]。同位素標(biāo)記法研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)C—P鍵的斷裂，PG2982能將草甘膦代謝成肌氨酸[18]，雖然PG2982降解草甘膦延滯期較長(zhǎng)，但是為草甘膦降解菌的篩選奠定了基礎(chǔ)。此后，陸續(xù)分離得到有草甘膦降解活性的假單胞菌[19-23]、產(chǎn)堿桿菌[23]、黃桿菌[24]、節(jié)桿菌[25-26]和根瘤菌[27]，而Krzysko等則發(fā)現(xiàn)土壤中的真菌也具有降解草甘膦的能力[28-29]。早期研究的降解菌多是以草甘膦為唯一磷源，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多微生物也可以利用草甘膦作為碳氮源，節(jié)桿菌GLP-1的變種[26]、產(chǎn)黃青霉菌[30]被發(fā)現(xiàn)能利用草甘膦作為唯一氮源，鏈霉菌[31]則是將草甘膦作為唯一碳氮源，而青霉T1[32]和曲霉B21[33]對(duì)草甘膦也都表現(xiàn)出明顯降解特性，降解率都在50%以上，B21對(duì)草甘膦的降解率甚至可達(dá)97%。

近年來(lái)，草甘膦的研究也取得許多進(jìn)展，Sviridov等分別從甲基膦酸和草甘膦污染的土壤中分離出無(wú)色桿菌MPS12和蒼白桿菌GPK3，將MPS12在含草甘膦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MPS12A同樣具有降解草甘膦的能力，這2株菌都是以草甘膦為唯一磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，將草甘膦分別降解成肌氨酸和AMPA[34]。Hadi等在無(wú)膦培養(yǎng)基中也篩選出蒼白桿菌GDOS，能將草甘膦降解為AMPA，GDOS在含磷培養(yǎng)基中對(duì)草甘膦還有降解能力，并且是報(bào)道的第一個(gè)能在幾天內(nèi)將毫摩爾草甘膦完全降解的純菌，這對(duì)于污染土壤修復(fù)和廢水治理具有重要意義[35]?？导o(jì)婷等對(duì)采自農(nóng)藥廠污水處理池的活性污泥樣本進(jìn)行篩選，共分離27株解磷細(xì)菌，復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)假單胞菌BR13、摩根氏菌BR57對(duì)草甘膦都有降解作用，降解率均在50%以上[36]。Selvi等發(fā)現(xiàn)的假單胞菌T5以草甘膦為唯一磷源，并且在該菌中首次分離了有C—P裂解活性的酶[37]。Moneke等對(duì)不同菌株進(jìn)行草甘膦降解特性的研究，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌和醋酸桿菌在含7.2～25 mg/mL草甘膦培養(yǎng)基中顯著增長(zhǎng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的草甘膦降解特性[38]。Kryuchkova等從根瘤菌中篩選出5株能耐受草甘膦的細(xì)菌，進(jìn)一步篩選出陰溝腸桿菌K7，該菌以草甘膦為唯一磷源，將其降解為肌氨酸，不僅如此，這類(lèi)細(xì)菌還能侵入向日葵和甜高粱的根部，促進(jìn)根苗的生長(zhǎng)，有益于草甘膦污染土壤的治理和修復(fù)[39]。

由Fan等分離出的蠟樣芽孢桿菌CB4是以草甘膦為唯一碳源，對(duì)草甘膦降解率可達(dá)94.5%，是第一個(gè)報(bào)道的能降解草甘膦的蠟樣芽孢桿菌[40]。其后，Zhan等分離出的蠟樣芽孢桿菌HYC-7，則是以草甘膦為唯一氮源生長(zhǎng)[41]。而韓麗珍等從長(zhǎng)期使用草甘膦的土壤中篩選得到節(jié)桿菌HX-5，以草甘膦為唯一碳氮源，降解率達(dá)到74.8%[42]。葉明等也發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌A5能以草甘膦為碳氮源，72 h對(duì)草甘膦的降解率達(dá)94.2%[43]。多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9是李冠喜等篩選出的高效解磷細(xì)菌，在生物降解農(nóng)藥殘留功能的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌在以草甘膦為唯一碳源、氮源或磷源培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，優(yōu)化發(fā)酵條件后，試驗(yàn)條件下該菌對(duì)草甘膦的降解率最高可達(dá)72.8%[44]。湯明強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)膠紅酵母能以草甘膦為唯一碳氮源[45-46]，而吳學(xué)華等發(fā)現(xiàn)的米曲霉A-F02，能以草甘膦為碳源，培養(yǎng)7 d對(duì)草甘膦的降解率為86.8%[47]。

2 微生物對(duì)草甘膦的降解途徑

隨著草甘膦降解菌研究的深入，菌株的降解途徑也逐漸被闡明，微生物主要通過(guò)2條途徑降解草甘膦，碳磷鍵（C—P鍵）斷裂生成肌氨酸和碳氮鍵（C—N鍵）斷裂生成氨甲基膦酸（AMPA）（圖1）[48]。

2.1 肌氨酸途徑

由Moore等篩選出的第1株草甘膦降解菌假單胞菌PG2982，是通過(guò)肌氨酸途徑降解草甘膦[17]，C—P鍵對(duì)化學(xué)反應(yīng)和酶促反應(yīng)有很高的穩(wěn)定性，在微生物C—P裂解酶的作用下，草甘膦C—P鍵斷裂，生成肌氨酸，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供磷源。此前，因?yàn)镃—P裂解酶在胞外容易發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的失活，這使得草甘膦特異性的C—P裂解酶一直是個(gè)謎[49]。最近，Selvi等從惡臭假單胞菌T5中分離出有活性的C—P裂解酶，從而揭開(kāi)了該酶的神秘面紗。這是第1個(gè)純化出的草甘膦特異性的C—P裂解酶，活性比無(wú)細(xì)胞萃取液提高600多倍，這對(duì)于草甘膦降解菌的深入研究有重要意義[37]。另一方面，生成的肌氨酸在肌氨酸氧化還原酶的作用下，快速代謝生成甲醛和甘氨酸，參與微生物的多個(gè)生理循環(huán)[18，50]。

2.2 AMAP途徑

參與氨甲基膦酸（AMPA）途徑的酶主要是草甘膦氧化還原酶（GOX），在該酶作用下，草甘膦C—N鍵斷裂，生成氨甲基膦酸（AMPA）和乙醛酸[48]。截至目前，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單一微生物能通過(guò)該途徑完全礦化草甘膦，大部分AMPA被微生物分泌出胞外進(jìn)入環(huán)境，或被其他微生物吸收，發(fā)生C—P鍵斷裂，最終礦化；乙醛酸則作為三羧酸循環(huán)的底物，參與微生物正常的代謝途徑[19，24-25，48，51]。最近，Sviridov等發(fā)現(xiàn)磷酸水解酶可能參與了蒼白桿菌GPK3的AMPA降解，并提出一個(gè)假設(shè)：AMPA首先在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，生成磷酸甲醛，進(jìn)而作為磷酸水解酶的底物，發(fā)生水解，生成甲醛和磷酸（圖2）[34]，然而到目前為止，磷酸水解酶在AMPA代謝途徑中的作用也僅限于假設(shè)，還沒(méi)有研究提出直接的證據(jù)證明這一假設(shè)[23，52]。

研究還發(fā)現(xiàn)，1株降解菌還可能同時(shí)存在2種降解方式，例如GPK3，主要是經(jīng)過(guò)AMPA途徑降解草甘膦，同時(shí)還能檢測(cè)到痕量的肌氨酸[34]，表明GPK3也可通過(guò)C—P鍵斷裂降解草甘膦，相同的現(xiàn)象也出現(xiàn)在假單胞菌LBr的降解中[19]。

而Dick等對(duì)篩選出的163株微生物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)篩選出的26株降解菌在磷饑餓的情況下能以草甘膦為唯一磷源將其降解，生成肌氨酸而不是AMPA[53]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌氨酸途徑在磷缺乏情況下才會(huì)發(fā)生，而環(huán)境中大都存在充足的磷源，能滿(mǎn)足微生物的需求，因此草甘膦在環(huán)境中主要代謝生成AMPA[16]，而肌氨酸途徑只存在于實(shí)驗(yàn)室磷饑餓壓力下篩選出來(lái)的降解菌中。這些表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，經(jīng)過(guò)肌氨酸途徑代謝的降解菌，是將草甘膦作為唯一磷源，誘導(dǎo)C—P裂解酶生成，而在自然環(huán)境下，環(huán)境中充足的磷源會(huì)負(fù)調(diào)節(jié)裂解酶，降解菌失去裂解草甘膦的能力；同時(shí)，不同于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，惡劣的自然環(huán)境也造成篩選菌株的不生長(zhǎng)和降解能力的喪失，這都給草甘膦的實(shí)際應(yīng)用提出了難題[19，26，54]。

可以看出，草甘膦降解菌的降解方式復(fù)雜多變，還需進(jìn)行深入研究，而缺少準(zhǔn)確、可靠的酶活性測(cè)定方法限制了對(duì)酶活性的研究。對(duì)草甘膦代謝途徑和降解活性的研究，以同位素標(biāo)記的草甘膦為底物，經(jīng)代謝后，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行NMR研究，是研究草甘膦代謝途徑的一種有效方法[19，55]，但該方法對(duì)設(shè)備要求高。或?qū)⒉莞熟⒓捌浯x產(chǎn)物衍生化[40，56]，衍生化后經(jīng)過(guò)不同檢測(cè)手段，如高效液相色譜[56-57]、氣相色譜[58-61]、薄層色譜[25，62]、毛細(xì)管電泳[63-64]等，對(duì)降解產(chǎn)物及降解途徑進(jìn)行分析，用于鑒別草甘膦氧化還原酶和C—P 裂解酶的活性；但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中成分復(fù)雜，不同成分發(fā)生交叉，影響目標(biāo)產(chǎn)物的辨識(shí)，干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，探尋精確、有效的草甘膦及其代謝產(chǎn)物的分析方法，對(duì)于解析草甘膦代謝方式，闡明微生物降解草甘膦的機(jī)理具有重要意義。

3 原位修復(fù)研究

目前，生物降解草甘膦還局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，用于原位修復(fù)草甘膦污染的研究還很少，僅有少數(shù)土著微生物降解草甘膦的研究被報(bào)道[65-66]。而在分離的純菌原位修復(fù)研究中，Shushkova等在被污染土壤中引入人蒼白桿菌GPK3和無(wú)色桿菌Kg16，結(jié)果表明其對(duì)草甘膦的降解率比土著微生物菌群提高了數(shù)倍[67-68]。在引入降解菌的1～2周內(nèi)，污染土壤的草甘膦含量、總體毒性水平、對(duì)植物的毒性水平已經(jīng)恢復(fù)至正常土壤水平，而草甘膦濃度降低，使得土壤微生物活性恢復(fù)，表現(xiàn)為土著微生物的脫氫酶活性和生物量分別提高了12倍和1.6倍[67]。研究還顯示降解能力跟土壤的垂直分布相關(guān)，只有土壤表層0～10 cm深的草甘膦可以被土著微生物和引入的微生物迅速降解，而10～30 cm深的土壤會(huì)因?yàn)闆](méi)有降解菌GPK3，并且土著微生物的數(shù)量少而發(fā)生草甘膦蓄積，同時(shí)草甘膦會(huì)隨著時(shí)間推移滲入土壤深處，雨水加速這一過(guò)程，影響草甘膦的降解[68]。

目前為止，還沒(méi)有1株篩選得到的純菌成功用于原位修復(fù)草甘膦污染的實(shí)例，主要原因在于，與其他微生物降解所遇到的難題相同，引入的微生物的生存競(jìng)爭(zhēng)力不如土著微生物，同時(shí)惡劣的環(huán)境條件也不利于降解菌生存，使之在生存競(jìng)爭(zhēng)壓力下沒(méi)有余力修復(fù)污染[54]；而且，原位修復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，土壤中充足的磷源抑制微生物對(duì)草甘膦的利用，實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高效降解菌，在實(shí)際應(yīng)用中卻無(wú)法發(fā)揮作用[19，26]。

4 結(jié)語(yǔ)

草甘膦的使用，在造福人類(lèi)的同時(shí)，也帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境和生態(tài)危害，微生物降解低毒、低耗，不會(huì)引入新污染，對(duì)于農(nóng)藥的治理是一種有效的手段，并且，環(huán)境殘留的草甘膦主要通過(guò)微生物降解，這引導(dǎo)科學(xué)家們?cè)诓莞熟⒔到饩暮Y選上進(jìn)行努力，試圖找到有效方法，緩解或消除草甘膦帶來(lái)的環(huán)境危害。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物能以草甘膦為唯一的磷源、碳源或氮源，表現(xiàn)出極高的降解率，但目前的研究還僅僅處于實(shí)驗(yàn)室階段，還沒(méi)有在原位引入降解菌，成功修復(fù)受污染體系的應(yīng)用實(shí)例。而且，在考慮生物修復(fù)有效性的同時(shí)，外源生物的引入是否會(huì)帶來(lái)二次污染和生態(tài)危害，都需要考慮、研究和解決，這給生物修復(fù)環(huán)境污染的實(shí)際應(yīng)用提出更多挑戰(zhàn)。

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