QuEChERS EMR- Lipid- LC/MS/MS測定8種β-受體激動劑

李磊，李海暢，高婧，周貽兵（.貴州省疾病預防控制中心衛(wèi)生監(jiān)測檢驗所，貴州貴陽550004；.貴陽市疾病預防控制中心，貴州貴陽55000）

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QuEChERS EMR- Lipid- LC/MS/MS測定8種β-受體激動劑

李磊1，李海暢2，高婧1，周貽兵1
（1.貴州省疾病預防控制中心衛(wèi)生監(jiān)測檢驗所，貴州貴陽550004；2.貴陽市疾病預防控制中心，貴州貴陽550002）

摘要：建立以QuEChERS EMR-Lipid為前處理測定動物源性食品中8種β-受體激動劑的LC-MS/MS方法。樣品經粉碎混勻后加入pH為5.2乙酸-乙酸銨溶液，以β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解液經QuEChERS EMR-Lipid凈化后，取乙腈層與0.1%的甲酸水溶液混合上LC-MS/MS進行分析。8種β-受體激動劑在測定濃度范圍內線性關系良好，各組分相關系數R2＞0.998，加標回收率范圍79.1%～94.8%，方法精密度范圍5.4%～9.4%，測定各組分β-受體激動劑檢出限范圍0.2μg/kg～0.4μg/kg，定量限范圍0.5μg/kg～1.0μg/kg。

關鍵詞：β-受體激動劑；高效液相色譜串聯質譜；QuEChERS；脂質去除；肉制品

β-受體激動劑又名瘦肉精，是一類人工合成藥物，具有營養(yǎng)在分配作用，可明顯提高瘦肉率，上世紀中期曾被廣泛添加于畜禽類飼料中［1-2］。人體攝入含有β-受體激動劑的動物組織將會出現肌肉震顫、心悸、惡心、眩暈和緊張等癥狀［3］。我國在2002年將β-受體激動劑列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》［4］。然而在經濟利益的驅使下，依然存在β-受體激動劑濫用的問題。

目前對于肉制品中β-受體激動劑的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法［5-6］、液相色譜法［7］和液相色譜-串聯質譜法［8-9］。氣相色譜-質譜法由于需要進行衍生后測定，操作過程復雜，不適用于多種目標物同時分析。液相色譜法使用保留時間進行定性，由于肉制品基質復雜，容易受到基質干擾出現假陽性結果。液相色譜-串聯質譜法特異性強、靈敏度高，是現階段測定β-受體激動劑的首選方法，但是由于其前處理過程主要依賴于固相萃取法進行凈化，操作過程復雜，分析成本高昂。本文在已有研究基礎上，使用增強型脂質快速凈化（QuEChERS EMR-Lipid）前處理方法對肉制品進行凈化后測定8種β-受體激動劑，極大簡化了前處理方法，降低了分析成本，為β-受體激動劑的檢測提供了新的思路。

1　材料與方法

1.1主要儀器

TSQ Quantum三重四極桿串聯質譜儀、戴安U3000超高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish EMR-Lipid：安捷倫科技有限公司；3-30KS離心機：德國Sigma公司；SB25-12YDTD超聲水浴鍋：寧波新芝生物科技公司；UP1600超純水機：艾普科技公司。

1.2標準品及試劑

標準品非諾特羅、福莫特羅、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、妥布特羅、異丙喘寧（純度≥95.5%）：購自Dr.Ehrenstorfer公司；β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶：購自德國sigma公司；甲醇、甲酸（HPLC純）：購自美國Fisher公司；乙腈（HPLC純）：購自德國Merck公司；乙酸銨、乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3樣品前處理

稱取粉碎混勻后的樣品2.0 g，于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH 5.2）10 mL，加入β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶20 μL，漩渦混勻后于37℃下過夜酶解。將酶解后樣品漩渦混勻，4℃下10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于增強型脂質快速凈化管中（QuEChERS dSPE EMRLipid）并加入5 mL乙腈漩渦混勻2 min，靜置1 min后于7 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液加入脂質凈化反萃取管中（QuEChERS Final Polish EMR-Lipid），漩渦混勻1 min后于5 000 r/min離心5 min。取上層乙腈0.5 mL與0.1%甲酸水0.5 mL混合后過0.45 μm濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.4超高效液相色譜及質譜條件

1.4.1超高效液相色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold（200 mm×2.1 mm，1.9 μm）（Thermo Fisher公司）；進樣量10 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃。梯度進樣程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+模式）；多反應監(jiān)測MRM模式；噴霧電壓正離子模式3 000 V；離子源溫度320℃；脫溶劑溫度270℃；鞘氣（N2）40 arb；輔助氣（N2）8 arb。質譜條件參數見表2。

表2　質譜參數Table 2 Mass condition

2　結果與討論

2.1 QuEChERS EMR-Lipid與固相萃取小柱凈化效果對比

由于肉制品基質成分復雜，測定動物源性食品β-受體激動劑前必須經過除脂凈化后才能進行質譜分析，而目前凈化方法主要依賴于固相萃取法來完成［8-9］。固相萃取法作為前處理的經典方法，雖然有廣泛的應用基礎，但是操作過程繁瑣，材料和時間成本都相對較高，且在上樣及淋洗過程中容易產生吸附不完全而導致穿透使分析目標物損失。QuEChERS EMR-Lipid方法作為QuEChERS的改良方法，不僅具有QuECh－ERS快速、易操作的特點，對于質譜分析還具有高效的凈化能力。在實際應用中對比兩種前處理方法的加標回收率測定結果見表3。

表3　不同前處理方法加標回收率結果（n = 6）Table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

續(xù)表3　不同前處理方法加標回收率結果（n = 6）Continue table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

2.2酶解提取條件與QuEChERS凈化條件的選擇

QuEChERS EMR-Lipid法在測定動物源性食品中多殘留時，使用乙腈進行直接提取［10］，但β-受體激動劑在動物體內多以結合態(tài)形式存在，在提取前應進行酶解使得結合態(tài)的β-受體激動劑變?yōu)橛坞x態(tài)才能獲得較高提取效率。筆者利用0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH 5.2）中的β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶破壞苯酚類、間苯二酚類β-受體激動劑苯環(huán)上的羥基結合位點，使β-受體激動劑由結合態(tài)轉化為游離形態(tài)后，改良了QuEChERS EMR-Lipid操作，使得提取效率極大提高。

2.3色譜條件優(yōu)化

樣品經過EMR-Lipid Polish反萃后，直接使用乙腈層上機分析發(fā)現峰形出現分叉現象，考慮到方法靈敏度及峰形的尖銳、對稱，筆者將0.5 mL反萃后的乙腈與0.5 mL的0.1%甲酸水進行混合后上機測定，最終樣品測定峰形見圖1、圖2。

2.4質譜條件優(yōu)化

質譜優(yōu)化采用微量進樣泵連續(xù)進樣方式進行，將8種β-受體激動劑的標準溶液（10 ng/mL）進行一級質譜掃描，確定各個組分準分子離子，優(yōu)化噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、鞘氣、輔助氣條件，使8種β-受體激動劑母離子綜合響應強度達到最佳。將獲得的母離子進行二級質譜掃描，分別優(yōu)化8種β-受體激動劑的碎片離子，對碰撞能量、透鏡電壓進行優(yōu)化，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定性和定量離子。

圖2　樣品中萊克多巴胺、克倫特羅、福莫特羅、妥布特羅選擇反應監(jiān)測（MRM）掃描圖譜Fig.2 Rackdopamine，clenbuterol，formoterol，tulobuterol of samples MRM scan results

2.5方法線性及檢出限

將空白基質樣品，按照方法1.3進行處理，取乙腈層0.5 mL，另取8種β-受體激動劑的混合標準溶液0.5 mL混勻后配置成基質匹配的標準曲線，以響應強度的峰面積為縱坐標，以質量濃度（μg/L）作為橫坐標，繪制標準系列曲線，線性方程見表3。將線性范圍最低濃度點稀釋并上機測定，以3倍信噪比（S/N）響應時所對應的濃度（μg/kg）作為檢出限，以10倍信噪比（S/N）響應時所對應的濃度（μg/kg）作為定量限，結果見表3。

表3　8種β-受體激動劑線性方程、相關系數、檢出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 8 β-agonists

2.6方法回收率及精密度

選擇豬肉、豬肝樣品以低、中、高3個濃度進行加標回收試驗，低、中、高組加標回收試驗分別添加10、50、100 μg/kg質量濃度的混合標準物質，按照1.3所述樣品前處理方法進行處理后測定加標回收率，平行測定6組，考察方法精密度，結果見表4。試驗結果顯示各種β-受體激動劑的回收率范圍為79.1%～94.8%，精密度范圍為5.4%～9.4%。

3　結論

本文建立了以QuEChERS EMR-Lipid為前處理方法，并運用超高效液相色譜串聯質譜測定肉制品中8種β-受體激動劑的方法。該方法相對于固相萃取前處理方法，具有操作簡單，有較高的基質干擾消除能力，方法準確度、靈敏度高，能夠滿足肉制品中β-受體激動劑的檢測要求。

表4　8種β-受體激動劑加標回收率及精密度（n = 6）Table 4 Recoveries and RSD of 8 β-agonists（n = 6）

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Determination of 8 β-Agonists by QuEChERS EMR-Lipid-LC/MS/MS

LI Lei1，LI Hai-chang2，GAO Jing1，ZHOU Yi-bing1

（1. Clinical Laboratory，Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2. Guiyang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Key words：β-agonists；LC-MS/MS；QuEChERS；EMR-Lipid；meat

Abstract：A method with QuEChERS EMR-Lipid pretreatment for the determination of 8 β-agonists in animal tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was established. The crushed sample was added to sodium acetate（pH 5.2）and enzymatic hydrolysis by β-Glucuronidase/Arysulfatase. The sample was purified by QuEChERS EMR-Lipid and took the acetonitrile mixed with 0.1%formic acid solution，then detected by LC-MS/MS. The 8 kinds of β-agonists showed good linear relationship between the concentration range，components correlation coefficient R2＞0.998，standard addition recovery range between 79.1%-94.8%，precision range 5.4%-9.4%，LOD components range 0.2 μg/kg-0.4 μg/kg and LOQ components range 0.5 μg/kg-1.0 μg/kg.

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.042

作者簡介：李磊（1986—），男（漢），主管技師，碩士研究生，從事環(huán)境及食品衛(wèi)生檢驗。

收稿日期：2016-02-22