紫娟茶中花青素提取物的抗氧化性研究

戴妙妙（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海201114）

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紫娟茶中花青素提取物的抗氧化性研究

戴妙妙
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海201114）

摘要：紫娟茶由含酸甲醇提取后，經(jīng)過(guò)乙醚、氯仿的液液分配以及Amberlite XAD-7HP樹(shù)脂的吸附洗脫，得到花青素粗提物。針對(duì)花青素提取物，采用DPPH法、ABTS法、FRAP法研究探討了其抗氧化性及清除自由基的能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示，捕捉DPPH自由基的能力：紫娟茶中花青素提取物＞BHA＞BHT，清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力和FRAP抗氧化能力都是：BHA＞紫娟茶中花青素提取物＞BHT。

關(guān)鍵詞：紫娟茶；花青素；抗氧化性

紫娟茶樹(shù)是一種較特異的植株，具有紫莖、紫葉、紫芽（紫色的芽尖）的特征，以諧音為其取名“紫娟”（Zi juan）［1］。1985年初，云南茶研所研究人員在大葉群體茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn)這種樹(shù)種，它屬于山茶科（Theaeeae）山茶屬（Camellia）茶組植物（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）茶種（Camellia sinensis）中的普洱茶變種（C. sinensisvar. assamica）紫娟茶葉與普通的紫芽茶葉不同，特別是外形明顯不同，其加工成的烘青綠茶，干茶的色澤為紫色，湯色也為黑紫色，香氣純正，滋味濃強(qiáng)，在國(guó)內(nèi)茶葉中也屬于較罕見(jiàn)的品種。

紫娟茶中含有種類(lèi)豐富的活性成分，其芽葉經(jīng)過(guò)蒸餾得到的浸出物含量為44.58%，茶多酚（Tea Polyp Henols）的含量為35.52%，咖啡堿（Theine）31.01 mg/g，花青素29.14 mg/g，黃酮類(lèi)化合物12.82 mg/g，鋅30.25 mg/kg，氨基酸總量346.19 mg/g，兒茶素（Catechin）總量201.86 mg/g，其中的花青素含量高出普通紅芽茶（5 mg/g～10 mg/g）兩倍［2］。根據(jù)云南省茶葉研究所生化試驗(yàn)分析證明［1］，紫娟茶有降血壓、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病、抗高蛋白過(guò)敏及抗HIV宿主細(xì)胞功效等作用，并能緩解眼疲勞、預(yù)防視力下降等功效。其較高含量的鋅、黃酮類(lèi)、超量的花青素是其呈現(xiàn)上述功效的主要物質(zhì)。

花青素是一類(lèi)具有抗氧化、抗病毒、抗突變、預(yù)防心血管疾病等功能的黃酮類(lèi)化合物。但很少有茶葉中含有花青素的報(bào)道，茶葉中茶多酚也是一種廣為人知的功能性成分。雖然紫娟茶得到了一些初步研究，但大量的基礎(chǔ)化學(xué)解釋和生理活性功能的檢測(cè)尚未有任何報(bào)道。特別是紫娟茶既含有茶多酚又含有大量花青素，這兩類(lèi)主要活性物質(zhì)的協(xié)同作用、對(duì)身體機(jī)能代謝的影響也尚未得到任何科學(xué)論據(jù)的揭示。

因此本研究研究紫娟茶中花青素的生物活性，如抗氧化性的功效，將為功能食品的研制及食品深加工應(yīng)用提供參考。同時(shí)也對(duì)我國(guó)新品種茶的選育和種植推廣，以及茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展及科技含量的提升也有較大的促進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1原料

紫娟茶（市售），于4℃冰箱保藏，待用。

1.2儀器

CP214C電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；RE5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FE20精密pH計(jì)、XS105DU分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療機(jī)械五廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；90-1恒溫磁力攪拌器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；LGJ-18C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；P1000、P5000移液器：吉爾森公司；PE Lambda25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：珀金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3試劑

甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚均為AP純，鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉、六合水三氯化鐵均為AR純，無(wú)水乙醇均為HPLC純，過(guò)硫酸鉀均為AR純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（TFA）為HPLC純：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹(shù)脂：美國(guó)羅門(mén)哈斯公司；純度＞98.0%（GC）（T）的水溶性維生素E（Trolox）、純度＞97.0%的1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、純度＞97.0%為2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、純度＞98.0%（GC）的3-叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA）、純度＞99.0%（GC）的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：均采購(gòu)于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.4花青素的制備［3］

稱(chēng)取300 g紫娟茶葉于5 L燒杯中，加2%TFA甲醇浸提液至浸沒(méi)茶葉，4℃下避光靜置21 h，過(guò)濾收集濾液，殘?jiān)^續(xù)用2%TFA甲醇浸提液浸泡，4℃下避光靜置4 h，收集濾液，共重復(fù)3次。合并3次浸提濾液，得到紫娟茶浸提濾液約4 L。4 L紫娟茶浸提濾液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無(wú)甲醇?xì)埩?，得到紫娟茶粗提液約500 mL，調(diào)節(jié)pH＜2。500 mL紫娟茶粗提液，先用乙醚進(jìn)行3次～5次萃取，每次乙醚使用100 mL～200mL，直至有機(jī)層無(wú)色顯現(xiàn)，收集水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，乙醚能除去紫娟茶粗提液中的脂質(zhì)脂溶性色素等；再用氯仿進(jìn)行3次～5次萃取，每次氯仿使用100 mL～200 mL，至有機(jī)相無(wú)色，取水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，水溶液濃縮至300 mL，調(diào)節(jié)pH＜2，氯仿能除去紫娟茶粗提液中的咖啡堿。將300 mL紫娟茶粗提水溶液以16 mL/min的流速，緩慢滴入層析柱（Φ2.5 cm×60 cm）中，靜置20 min～30 min，使其充分吸附在樹(shù)脂上［4］。先用1 L 0.1%TFA水溶液洗脫，除去一些水溶性的單糖、氨基酸等小分子的雜質(zhì)；再用2 L0.1% TFA甲醇溶液洗脫，直至無(wú)有色物質(zhì)洗脫下來(lái)，收集洗脫液。將紫娟茶粗提洗脫液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無(wú)甲醇?xì)埩?，再將其置?60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0 Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到紫娟茶粗提物27.6 g。稱(chēng)取上述20.0 g紫娟茶粗提物于燒杯中，加400 mL乙酸乙酯，磁力攪拌30 min，進(jìn)行3次固液萃取，收集不溶固體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去乙酸乙酯，直至無(wú)乙酸乙酯殘留，再將其置于-60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0 Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到花青素粗提物4.3 g，于4℃冰箱保藏備用。

1.5抗氧化性的評(píng)價(jià)

1.5.1捕捉DPPH自由基的能力［5］

分別吸取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 mL 0.1 mg/mL Trolox乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，加4 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液，加無(wú)水乙醇定容至5 mL。室溫靜置30 min，用比色皿，于517 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別吸取0.1、0.2、0.3 mL 0.1 mg/mL樣液于容量瓶中，加4mL0.1mmol/LDPPH的乙醇溶液，加無(wú)水乙醇定容至5mL。室溫靜置30min，用比色皿，于517nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值。以無(wú)水乙醇代替樣品做空白。以BHA 與BHT作為陽(yáng)性對(duì)比。計(jì)算結(jié)果以Trolox mg/mL計(jì)。

1.5.2清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力［6］

分別吸取0、0.1、0.2、0.25、0.3、0.35 mL 0.1 mg/mL Trolox乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，加4 mL ABTS+試液，加無(wú)水乙醇定容至5 mL。室溫靜置5 min，用比色皿，于734 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別吸取0.05、0.1、0.15 mL 0.1 mg/mL樣液于容量瓶中，加4 mL ABTS+試液，加無(wú)水乙醇定容至5 mL。室溫靜置5 min，用比色皿，于734 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值。以無(wú)水乙醇代替樣品做空白。以BHA與BHT作為陽(yáng)性對(duì)比。計(jì)算結(jié)果以Trolox mg/mL計(jì)。

1.5.3FRAP法抗氧化試驗(yàn)［7］

分別吸取0、0.05、0.1、0.15、0.175、0.2 mL 0.1 mg/mL Trolox乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中加4 mL FRAP溶液，加無(wú)水乙醇定容至5 mL。升溫至37℃，靜置30 min，用比色皿，于593 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別吸取0.05、0.1、0.2 mL 0.1 mg/mL樣液于容量瓶中，加4 mL FRAP溶液，加無(wú)水乙醇定容至5 mL。升溫至37℃，靜置30 min，用比色皿，于593 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值。以無(wú)水乙醇代替樣品做空白。以BHA 與BHT作為陽(yáng)性對(duì)比。計(jì)算結(jié)果以Trolox mg/mL計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1花青素的制備

300 g紫娟茶葉，經(jīng)甲醇粗提→濃縮→乙醚、氯仿萃取→樹(shù)脂純化，獲得紫娟茶粗提物27.6 g深紅色多酚類(lèi)物質(zhì)，提取得率為9.2%；再經(jīng)乙酸乙酯萃取→冷凍干燥，得到花青素粗提物4.3 g深紫色花青素，提取得率為2.0%。由于花青素粗提物經(jīng)過(guò)冷凍干燥的物理處理，所以隨后的保存也必須為低溫，用時(shí)方可恢復(fù)至室溫；其次，因?yàn)榛ㄇ嗨毓夥€(wěn)定性較差，要保持鮮有的質(zhì)性，必須避光保存。

2.2抗氧化性的評(píng)價(jià)

2.2.1捕捉DPPH自由基的能力

2.2.1.1DPPH反應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在DPPH反應(yīng)體系中的顏色變化如圖1所示。

圖1　Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在DPPH反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.1 The color change of Trolox standard curve in the DPPH system

DPPH應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2　DPPH反應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The Trolox standard curve in the DPPH system

2.2.1.2 DPPH反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較

BHT、花青素、BHA在DPPH反應(yīng)體系中的顏色變化如圖3所示。

圖3　BHT、花青素、BHA在DPPH反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.3 The color change of BHT，Anthocyanin，BHA in the DPPH system

DPPH反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較柱狀圖如圖4所示。

圖4　DPPH反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較Fig.4 The antioxidant activity of BHT，anthocyanins，BHA in the DPPH system

由圖4所示，紫娟茶中花青素提取物與BHA、BHT捕捉DPPH自由基的能力，以Trolox當(dāng)量值表示，數(shù)值越大，捕捉能力越強(qiáng)。同等濃度下捕捉能力大小依次為紫娟茶花青素提取物＞BHA＞BHT。在0.002 mg/mL～0.006 mg/mL濃度范圍內(nèi)，紫娟茶花青素提取物、BHA、BHT都是呈遞增趨勢(shì)的。

2.2.2清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力

2.2.2.1ABTS反應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在ABTS反應(yīng)體系中的顏色變化如圖5所示。

圖5　Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在ABTS反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.5 The color change of Trolox standard curve in the ABTS system

ABTS應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

圖6　ABTS應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The Trolox standard curve in the ABTS system

2.2.2.2ABTS反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較

BHT、花青素、BHA在ABTS反應(yīng)體系中的顏色變化圖7所示。

圖7　BHT、花青素、BHA在ABTS反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.7 The color change of BHT，Anthocyanin，BHA in the ABTS system

ABTS反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較柱狀圖如圖8所示。

圖8　ABTS反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較Fig.8 The antioxidant activity of BHT，anthocyanins，BHA in the ABTS system

由圖8所示，紫娟茶中花青素提取物與BHA、BHT清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力，以Trolox當(dāng)量值表示，數(shù)值越大，清除能力越強(qiáng)。同等濃度下清除能力大小依次為BHA＞紫娟茶中花青素提取物＞BHT。在0.001 mg/mL～0.003 mg/mL濃度范圍內(nèi)，紫娟茶中花青素提取物、BHA、BHT都是呈遞增趨勢(shì)的。

2.2.3FRAP法抗氧化試驗(yàn)

2.2.3.1FRAP反應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在FRAP反應(yīng)體系中的顏色變化如圖9所示。

圖9　Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線在FRAP反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.9 The color change of Trolox standard curve in the FRAP system

FRAP應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10所示。

圖10　FRAP應(yīng)體系中Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 The Trolox standard curve in the FRAP system

2.2.3.2FRAP反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較

BHT、花青素、BHA在FRAP反應(yīng)體系中的顏色變化如圖11所示。

圖11　BHT、花青素、BHA在FRAP反應(yīng)體系中的顏色變化Fig.11 The color change of BHT，Anthocyanin，BHA in the FRAP system

FRAP反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較柱狀圖如圖12所示。

圖12　FRAP反應(yīng)體系中BHT、花青素、BHA抗氧化性比較Fig.12 The antioxidant activity of BHT，anthocyanins，BHA in the FRAP system

由圖12所示，在FRAP法抗氧化性試驗(yàn)中紫娟茶中花青素提取物與BHA、BHT抗氧化能力，以Trolox當(dāng)量值表示，數(shù)值越大，抗氧化能力越強(qiáng)。同等濃度下抗氧化能力大小依次為BHA＞紫娟茶中花青素提取物＞BHT。在0.001 mg/mL～0.004 mg/mL濃度范圍內(nèi)，紫娟茶中花青素提取物、BHA、BHT都是呈遞增趨勢(shì)的。

3　結(jié)論

在DPPH、ABTS、FRAP 3種不同的反應(yīng)體系里，比較了紫娟茶中花青素提取物和兩種常用合成抗氧化劑BHA、BHT的抗氧化性及清除自由基能力。結(jié)果顯示紫娟茶中花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性活性及較強(qiáng)的清除自由基的能力。

1）在捕捉DPPH自由基的能力試驗(yàn)中，紫娟茶中花青素提取物的捕捉能力要強(qiáng)于BHA和BHT。

2）在清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力試驗(yàn)中，紫娟茶中花青素提取物的清除能力要強(qiáng)于BHT，但弱于BHA。

3）在FRAP法抗氧化性試驗(yàn)中，紫娟茶中花青素提取物的抗氧化能力強(qiáng)于BHT，但弱于BHA。

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The Study on the Antioxidant Activity of Anthocyanins from Zi Juan Tea

DAI Miao-miao
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 201114，China）

Abstract：Anthocyanins from Zi juan tea were exteacted by using acid-containing methanol as solvent and patitioned with ether and chloroform. The extract of anthocyanins was purified by Amberlite XAD-7HP chro－matograpHy. The antioxidant and free radical scavenging capacity of anthocyanin extracts .were evaluated by DPPH method，ABTS method and FRAP method. The results showed that the ability of scavenging DPPH：anthocyanins extracts＞BHA＞BHT；the ABTS radical scavenging activities and the FRAP antioxidant：BHA＞anthocyanins extracs＞BHT.

Key words：Zi juan tea；anthocyanin；antioxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.010

作者簡(jiǎn)介：戴妙妙（1984—），女（漢），工程師，工程碩士，研究方向：產(chǎn)品安全研究。

收稿日期：2015-01-04