必特螺旋霉素發(fā)酵組分中亮氨酸的影響研究

杜仙娥 付聯(lián)群 李紅梅

必特螺旋霉素發(fā)酵組分中亮氨酸的影響研究

杜仙娥 付聯(lián)群 李紅梅

目的 研究分析必特螺旋霉素發(fā)酵組分中亮氨酸的影響。方法 在合成培養(yǎng)基中加入亮氨酸，觀察其對于必特螺旋霉素發(fā)酵組分的影響。結(jié)果 加入亮氨酸以后，對于初級代謝所產(chǎn)生的影響不大，可提高異戊酞基螺旋霉素組分以及總異戊?；菪浚r保持不變。討論 亮氨酸可使必特螺旋霉素主要組分作用機(jī)理得到提高。

亮氨酸；組分；效價；必特螺旋霉素

目前關(guān)于支鏈氨基酸代謝影響抗生素生物合成與相關(guān)酶方面的研究已非常多，曾有學(xué)者在avermectin生物合成研究中發(fā)現(xiàn)若突變菌株不含支鏈-2氧基脫氫酶活性，則不能在不含亮氨酸、纈氨酸以及異亮氨酸的合成培養(yǎng)基中正常生長[1]。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)報道研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸與脂肪酸類物質(zhì)對于鏈霉菌酞化抗生素產(chǎn)生具有誘導(dǎo)以及促進(jìn)作用[2-3]。

1 材料與方法

1.1 一般材料 所用菌株為含有異戊酞基轉(zhuǎn)移酶基的整合型螺旋霉素鏈霉菌F21，根據(jù)要求配制斜面培養(yǎng)基、生物效應(yīng)測定培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基。所用試劑有丁酸、乙酸、異戊酸、檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及丙酮酸，除α-酮戊二酸是生化試劑以外，其余均是分析純試劑，所用儀器有FUS-15L發(fā)酵罐，該儀器不僅配備常規(guī)測量控制，如溫度、DO、轉(zhuǎn)速和消泡等，還配備高精度補(bǔ)料測控，比如基質(zhì)、消泡劑以及酸堿等。

1.2 方法 采取PMV法對菌種濃度進(jìn)行測定。將10mL發(fā)酵液放在離心機(jī)進(jìn)行離心，時間為10min左右。根據(jù)中國藥典采取杯碟法對生物效價進(jìn)行測定，將乙酰螺旋霉素當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)品，而鑒定菌則是枯草芽孢桿菌。采取HPLC法對有機(jī)酸以及氨基酸進(jìn)行測定，主要如下：首先對樣品進(jìn)行處理，將必特螺旋霉素發(fā)酵液放在離心機(jī)進(jìn)行離心，時間共為10min，取上清液放在-20℃儲存?zhèn)溆?。分析時取1mL，進(jìn)行離心，而后用合成纖維素酯膜實施真空過濾。在測定有機(jī)酸時，α-酮戊二酸、乙酸、丙酮酸以及丙酸色譜柱為AquaSep，甲醇為98.4︰1.3，流動相為0.01mol/L磷酸水溶液，流速為每分鐘1mL，檢測器波長為210nm，且柱溫為30℃。測定異戊酸和丁酸時，色譜柱為Shimpack VP-ODS，甲醇為60︰40，流動相、流速條件均和乙酸等一致。在測定氨基酸時，所用色譜柱為AgilentDB-C18，柱溫為38℃，流速為每分鐘1mL，波長為254nm。借助于自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，采取三相洗脫。

2 結(jié)果

把亮氨酸添加至必特螺旋霉素發(fā)酵中，對于必特螺旋霉素生物合成和菌體生長所產(chǎn)生的影響明顯，生長期結(jié)束以后菌濃出現(xiàn)一定的波動，于48～72h內(nèi)略微上升；發(fā)酵后期，因培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，且菌體自溶，此時菌濃降低。加入氨基酸以后，菌體于產(chǎn)素期生長以及維持受抑制，此時菌濃下降范圍為1%～5%內(nèi)。加入氨基酸后的24h內(nèi)效價增長比較緩慢，加入亮氨酸后期生活效價與對照基本一樣。見圖1。加入亮氨酸后，必特螺旋霉素中異戊酸基螺旋霉素Ⅱ與Ⅲ明顯上升，總異戊酸基螺旋霉素含量也有所提高，而螺旋霉素所占比重則明顯降低。見表1。從該結(jié)果來看，亮氨酸可促進(jìn)必特螺旋霉素中異戊酞螺旋霉素合成。加入亮氨酸后培養(yǎng)基PH和對照相比要高，發(fā)酵液中銨離子為3.5nmol/L，糖耗速率為0.3～0.5g/(L?h)。當(dāng)加入亮氨酸時，檸檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性均發(fā)生顯著改變，同時初級以及次級代謝所受影響不大，對此效價也未發(fā)生較大改變，但必特螺旋霉素中總異戊酞螺旋霉素組份含量卻明顯上升。見圖2。必特螺旋霉素為短鏈脂肪酸單體通過聚酮合成酶頭尾縮合而形成，而這些短鏈酯酸酶濃度對于其生物合成可產(chǎn)生較大影響。加入亮氨酸后，乙酸濃度未發(fā)生顯著改變，胞外丙酸與對照大致一樣，胞外異戊酸濃度顯升高，于84h可達(dá)至166mmol/L，丁酸變化情況和對照基本一致，從該結(jié)果可知，加入亮氨酸對于丙酸以及乙酸的影響較小，效價變化小，而必特螺旋霉素中異戊酞基螺旋霉素組分所占比重明顯上升，可見亮氨酸通過分解代謝后所產(chǎn)生的這種異戊酸基CoA能當(dāng)作螺旋霉素4”側(cè)鏈前體。

圖1 添加亮氨酸至比特螺旋霉素發(fā)酵過程表示注：1表示對照,2表示亮氨酸

表1 亮氨酸對必特螺旋霉素組分的影響分析

圖2 添加亮氨酸時檸檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性變化情況注：1表示48h,2表示60h

3 討論

必特螺旋霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，基于螺旋霉素，經(jīng)4”-O異戊酞基轉(zhuǎn)移催化，于4”位置上和一系列酞基相接入，以此形成為多組分酞化螺旋霉素，同時該抗生素目前已通過Ⅱ期臨床研究，其組分中所含戊酞組分量對于其生物活性可產(chǎn)生較大影響[4-5]。經(jīng)藥效研究發(fā)現(xiàn)，必特螺旋霉素所具體外抗菌譜較廣，毒性較低，其藥效和乙酰螺旋霉素大致一樣，于體內(nèi)具有較好穩(wěn)定性[6]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)形成所需前體物質(zhì)有乙酸、丁酸以及丙酸，上述這些物質(zhì)均來自糖酵解途徑、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)和脂肪酸，不管是在初級代謝，還是在次級代謝中所扮演的角色均非常重要[7-8]。本次研究就必特螺旋霉素發(fā)酵組分中亮氨酸的影響進(jìn)行了研究分析，亮氨酸屬于一種支鏈氨基酸，聯(lián)合異亮氨酸、纈氨酸，可修復(fù)肌肉，可快速分解轉(zhuǎn)化成為葡萄糖，有效控制血糖，提供相應(yīng)的能量給身體組織。通過研究分析發(fā)現(xiàn)，加入亮氨酸對于必特螺旋霉素生物效價所產(chǎn)生的影響不是很顯著，但可使異戊酸基螺旋霉素含量顯著上升。加入亮氨酸以后，乙酸和丙酸未發(fā)生顯著變化。同時本次研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至36h時加入亮氨酸，異戊酸基螺旋霉素組分所占比例明顯上升，可見，亮氨酸通分解代謝后，所產(chǎn)生的這種異戊酸基Co A能被當(dāng)作螺旋霉素4”側(cè)鏈前體。此外，胞外異戊酸于48小時后積累于胞外，而后又在此被重新吸收至胞內(nèi)。加入亮氨酸以后和對照相比，發(fā)酵前期和中期效價均略低，結(jié)束時略高，究其原因可能是因糖耗速率和EMP途徑代謝通量相比，稍微下降，繼而造成前期效價比對照稍微低一些，而在后期則因乙酸積累，可使大環(huán)合成前體物質(zhì)得到補(bǔ)充，因此效價稍微上升。

綜上所述，亮氨酸作為支鏈氨基酸，有利于必特螺旋霉素發(fā)酵中組分以及效價的優(yōu)化。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.9.015

湖北 448000 荊門市第二人民醫(yī)院 （杜仙娥 付聯(lián)群 李紅梅）