宮頸永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞的核蛋白質(zhì)組分析

呂玉宇，趙　涌

1.重慶市第五人民醫(yī)院病理科(重慶 400062) 2.重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室(重慶 400016)

?

宮頸永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞的核蛋白質(zhì)組分析

呂玉宇1，趙涌2

1.重慶市第五人民醫(yī)院病理科(重慶 400062) 2.重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室(重慶 400016)

【摘要】目的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較和分析人宮頸上皮永生化細(xì)胞(H8細(xì)胞株)和宮頸癌細(xì)胞(Caski細(xì)胞株)核蛋白差異表達(dá)。方法蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜篩選H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞核蛋白的差異表達(dá)蛋白，Western blotting驗證篩選蛋白TRA16。結(jié)果成功建立H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞核蛋白雙向電泳圖譜，質(zhì)譜鑒定出9種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中有6種(TRA16、TIAF1、CDK6、PP4C、ZN211、ANR16)在Caski中高表達(dá)，有3種(INT6、MYST1、LMNA)在H8細(xì)胞中高表達(dá)，TRA16在Caski中表達(dá)高于H8細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)論篩選出的H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞差異表達(dá)的核蛋白為尋找新的宮頸癌及癌前病變標(biāo)記物提供幫助。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌；核蛋白；蛋白組分析；TRA16

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，近年來宮頸癌發(fā)病率有明顯增高及年輕化趨勢[1]， 研究證實高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染引起宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變，但兩者之間的關(guān)鍵性差異蛋白質(zhì)及癌變機(jī)制至今仍不清楚。筆者前期分離提取宮頸癌細(xì)胞(Caski細(xì)胞)和處于癌前狀態(tài)的宮頸永生化細(xì)胞(H8細(xì)胞)的亞細(xì)胞成分蛋白(細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞骨架)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對兩者的細(xì)胞核進(jìn)行差異蛋白分析，篩選參與宮頸癌變過程的差異蛋白，為進(jìn)一步闡明其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制及尋找新的特異性生物學(xué)標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)提取試劑盒Calbiochem購于德國Merck生物制劑公司；IPG Buffer、ReadyStrip IPG Strip(PH3-10，18 cm)購于Amersham公司；寬范圍分子量蛋白標(biāo)記購自TaKaRa公司；CAN、TFA為Sigma公司產(chǎn)品；胰酶(Trypsin Glod，Mass Spectrometry Grade)購于Promega公司；Western所用TRA16(sc-244486)、β-Actin(sc-47778)為Santa Cruz公司產(chǎn)品，F(xiàn)ermentas公司預(yù)染Maker，PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品。雙向電泳儀購于Amersham公司；高速離心機(jī)購于德國Eppendorf公司，ImageMaster凝膠成像系統(tǒng)及PDQuest圖像分析軟件為Amersham pharmacia公司產(chǎn)品；MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀為美國ABI公司產(chǎn)品；電泳儀、半干電轉(zhuǎn)儀購于美國Bio-Rad公司。人宮頸鱗狀上皮永生化H8細(xì)胞株源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所，人宮頸鱗狀細(xì)胞癌Caski細(xì)胞株從重慶醫(yī)科大學(xué)分子生物教研室獲得，兩者均為HPV16陽性。

1.2 方法

1.2.1樣品制備前期按照亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)提取試劑盒操作步驟分別提取H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白[2]，進(jìn)行蛋白定量。

1.2.2雙向凝膠電泳(2-DE)分離和圖像分析取細(xì)胞株核蛋白按前期實驗方法和步驟[2]進(jìn)行，分別通過第一向等電聚焦電泳和第二向垂直電泳直至凝膠底部邊緣停止，銀染，4℃保存。得到重復(fù)性較好的凝膠掃描成像，隨后軟件對圖像進(jìn)行對比分析，獲得差異表達(dá)的候選斑點。

1.2.3質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢切取需要分析的候選斑點，經(jīng)膠內(nèi)酶切、萃取、濃縮抽干后進(jìn)行肽指紋圖譜法(PMF)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，使用MASCOT軟件和MS-Fit軟件采用Swissprot、NCBI數(shù)據(jù)庫查詢匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

1.2.4Western blotting驗證差異蛋白TRA16分別取兩細(xì)胞核蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后半干電轉(zhuǎn)膜，判斷轉(zhuǎn)移成功后，封閉PVDF膜，加入TRA16抗體(1∶200)或β-Actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)室溫?fù)u床孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影，目的條帶用圖像分析軟件Quantity-one進(jìn)行光密度積分值分析，以β-Actin為內(nèi)參照，計算兩者的積分光密度值(IOD)的比值即為TRA16的相對表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞核蛋白雙向電泳圖譜分析獲得清晰易辨、蛋白點滿意的H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞核蛋白雙向凝膠電泳圖譜(圖1)。通過Image Master軟件分析，H8細(xì)胞凝膠(左)上共有649個點， Caski細(xì)胞凝膠(右)上共有723個點，匹配率為72.35%，兩者斑點主要集中在PI為5～9和分子量為10～180 kDa的區(qū)域，經(jīng)軟件分析篩選出30個蛋白點的表達(dá)量存在明顯差異，有17個點在Caski細(xì)胞核明顯上調(diào)，有13個點在H8細(xì)胞中明顯下調(diào)。

圖1　H8細(xì)胞(左)和Caski細(xì)胞(右)核蛋白雙向凝膠電泳圖

2.2 差異蛋白點的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別對篩選出的30個差異表達(dá)蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中9個點鑒定得到相關(guān)的信息(圖2，圖3)，其中TRA16、TIAF1、CDK6、PP4C、ANR16、ZN211 6種蛋白在Caski細(xì)胞核中表達(dá)明顯上調(diào)，MYST1、INT6、LMNA 3種蛋白質(zhì)在H8細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，見表1。

2.3TRA16蛋白Western blotting結(jié)果 Western blotting檢測證實TRA16在兩種細(xì)胞的表達(dá)存在明顯差異(圖4)；TRA16在Caski細(xì)胞表達(dá)高于H8細(xì)胞(P<0.05)，見表2。

圖2　TRA16 PMF圖譜

圖3　TRA16 Mascot檢索鑒定結(jié)果

編號檢索結(jié)果NameMr/pI2*TIAF1TGFβ1-inducedanti-apoptoticfactor1TGFβ1誘導(dǎo)的抗調(diào)亡因子112406/8.355*TRA16TR4orphanreceptor-associated16kDaprotein睪丸激素受體相關(guān)蛋白16037/5.768*PP4CSerine/threonine-proteinphosphatase4catalyticsubunit絲/蘇氨酸型磷酸蛋白酶4催化亞基35628/4.919*CDK6Celldivisionproteinkinase6細(xì)胞周期蛋白激酶637257/6.0213*ANR16Ankyrinrepeatdomain-containingpro-tein16錨蛋白重復(fù)序列1640000/6.8214*ZN211Zincfingerprotein211鋅指蛋白21143724/9.2821﹟MYST1ProbablehistoneacetyltransferaseMYST1組蛋白乙酰化酶MYST152883/8.4725﹟LMNALamin-A/C核纖層蛋白A/C74380/6.5727﹟INT6Integratorcomplexsubunit6多蛋白復(fù)合體亞基6100954/8.79

注：*為Caski高表達(dá)；﹟為H8高表達(dá)。

圖4　Western blotting檢測TRA16蛋白結(jié)果

Caski1.0617±0.00313H80.0582±0.00726

3討論

蛋白質(zhì)組學(xué)用于鑒定研究對象的全部蛋白，尋找與疾病相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)、診斷疾病的分子標(biāo)記以及藥物治療的相關(guān)靶點[3]。實驗通過對宮頸癌前和癌細(xì)胞核蛋白的差異蛋白質(zhì)組分析，得到了清晰易辨、重復(fù)性較好的H8和Caski細(xì)胞核蛋白圖譜，獲得30個差異候選蛋白點并檢測出9種差異蛋白，其中MYST1、INT6、LMNA 3種蛋白質(zhì)在H8細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)；而TRA16、TIAF1、CDK6、PP4C、ANR16、ZN211這6種蛋白質(zhì)在Caski細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，這些蛋白可能與細(xì)胞周期及有絲分裂有關(guān)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗凋亡等途徑促進(jìn)宮頸細(xì)胞癌變。

MYST1在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和染色體修飾方面發(fā)揮重要作用，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、癌癥的發(fā)生等細(xì)胞過程[4]。INT6(eIF3e)即真核翻譯起始因子，參與細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的調(diào)控，其基因是鼠乳腺癌病毒基因組的整合位點，已經(jīng)在人類多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，尤其是上皮性腫瘤中檢測到INT6的水平顯著升高，Grzmil等[5]對人乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)INT6的表達(dá)水平與腫瘤分化分級呈正相關(guān)，揭示其參與癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡。LMNA是中間纖維蛋白家族的重要成員，其多聚體組成的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)緊貼于核膜內(nèi)側(cè)，與核組裝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、染色體分離和DNA修復(fù)等多種細(xì)胞功能有關(guān)[6]。

TIAF1是TGFβ1誘導(dǎo)的抗調(diào)亡因子1，能抑制腫瘤壞死因子TNF-α對成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，參與TGFβ抑制NF-κB的表達(dá)和TNF介導(dǎo)的NF-κB降解過程，并協(xié)同p53對細(xì)胞凋亡有抑制作用[7]。PP4C是蛋白磷酸酶PP2A家族的重要成員之一，通過與不同的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合形成磷酸酶復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號通路和中心體成熟、剪接體復(fù)合物組裝以及同源染色體重組在內(nèi)的重要功能[8]。CDK6即細(xì)胞周期蛋白激酶6，通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學(xué)作用驅(qū)動細(xì)胞周期，和周期蛋白cyclin協(xié)同作用，是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子。筆者前期在Caski細(xì)胞胞質(zhì)蛋白中也鑒定出CDK6表達(dá)明顯上調(diào)[9]，Murphy等[10]通過對正常宮頸上皮、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的對比研究揭示p16INK4A的部分抑癌機(jī)制，即滅火CDK4/CDK6的活性致使細(xì)胞周期減緩。ZN211鋅指蛋白是轉(zhuǎn)錄因子的重要組成部分。ANR16錨蛋白重復(fù)序列是介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，廣泛參與細(xì)胞中各種生命活動的調(diào)節(jié)。

TRA16是一種與睪丸激素孤核受體4(TR4)相關(guān)的蛋白，含有139個氨基酸，位于人染色體19p12，分子量16 kDa，細(xì)胞免疫熒光實驗顯示TRA16 和TR4共同存在細(xì)胞核膜上[11]，本實驗在核蛋白中發(fā)現(xiàn)了TRA16的差異表達(dá)，與其他研究[11]對TRA16的胞內(nèi)定位情況一致。本研究發(fā)現(xiàn)TRA16在Caski細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，隨后的免疫印跡實驗也證實了這一結(jié)果，推測其通過核受體對基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長以及增殖過程發(fā)揮了調(diào)控作用。TRA16作為一種新近發(fā)現(xiàn)的性激素相關(guān)核受體的相關(guān)蛋白，在宮頸癌細(xì)胞核內(nèi)具有特異性的表達(dá)，認(rèn)為TRA16可能與宮頸上皮癌變過程有關(guān)，但其如何參與HPV病毒整合至宿主基因組導(dǎo)致宮頸癌變的機(jī)制，以及在分化程度不同的腫瘤中是否存在表達(dá)強(qiáng)度的差異，這些問題都有待今后通過大樣本的對比分析進(jìn)一步明確。

本實驗通過差異蛋白質(zhì)分析H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞的核蛋白，得到了一些可能參與宮頸上皮癌變過程的蛋白質(zhì)，并證實了TRA16蛋白在癌細(xì)胞中的高表達(dá)，為宮頸癌提供了潛在的新分子標(biāo)記和藥物靶點的篩選參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張麗萍，葉能勝，谷學(xué)新.宮頸癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，17(18)：2 754-2 756.

[2]宋大萍，趙涌，巫靜嫻.宮頸永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白雙向電泳圖譜的建立及初步分析[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，33(2)：166-168.

[3]張姣麗，賈小芳，呂建新，等.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌相關(guān)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2014，41(10)：771-774.

[4]Sapountzi V，Coté J.MYST-family histone acetyltransferases：beyond chromatin[J].Cell Mol Life Sci，2011，68(7)：1 147-1 156.

[5]Grzmil M，Rzymski T，Milani M，et al.An oncogenic role of eIF3e/INT6 in human breast cancer[J].Oncogene，2010，29(28)：4 080-4 089.

[6]鄭偉，曾晶，徐進(jìn).核纖層蛋白與核纖層病的研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2012，34(12)：1 287-1 293.

[7]Schultz L，Khera S，Sleve D，et al.Chang NS TIAF1 and p53 functionally interact in mediating apoptosis and silencing of TIAF1 abolishes nuclear translocation of serine 15-phosphorylated p53[J].DNA & Cell Biol，2004，23(1)：67-74.

[8]Xie Y，Jüschke C，Esk C，et al.The phosphatase PP4c controls spindle orientation to maintain proliferative symmetric divisions in the developing neocortex[J].Neuron，2013，79(2)：254-265.

[9]宋大萍，呂玉宇，趙涌.宮頸永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究[J].華西醫(yī)學(xué)，2014，29(1)：51-53.

[10]Murphy N，Heffron CC，King B，et al.p16INK4A positivity in benign， premalignant and malignant cervical glandular lesions： a potential diagnostic problem [J].Virchows Arch，2004，445(6)：610-615.

[11]Zheng QF，Dong B，Sun Y，et al.Expression of TR4-associated protein in non-small cell lung cancer [J].Beijing Da Xue Xue Bao，2007，39(5)：472-475.

責(zé)任編輯：艾茜

Differential Analysis of Nucleus Proteins of Immortalized Cervical Cell and Cervical Cancer Cell

Lyu Yuyu1,Zhao Yong2

(1.DepartmentofPathology,theFifthPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400062,China；2.DepartmentofParthology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

【Abstract】Objective To compare and analyze the nucleus proteins of human endocervical cells (H8) and cervical cancer cells (Caski) by two dimensional electrophoresis(2DE) and Mass Spectrometry(MS).Methods The differential expression nucleus proteins of H8 cells and Caski cells were selected by 2-DE and MS,and TRA16 was identified by Western blotting.Results Two-dimensional proein maps of H8 cells and Caski cells were obtained. 9 notable differential nucleus protein spots were detected in 2-DE gels.Among the proteins identified,6 proteins(TRA16,TIAF1,CDK6,PP4C,ZN211,ANR16)were up-regulated in Caski cells,and 3 proteins(INT6,MYST1,LMNA) were up-regulated in H8 cells.TRA16 express better than H8 in caski cells(P<0.05).Conclusion There are differentially expressed proteins in H8 cells and Caski cells which may become potential and valuable diagnostic markers for cervical cancer and CIN.

【Key words】cervix cancer;nucleus protein;proteomic analysis;TRA16

作者簡介呂玉宇(1977- )，女，湖北宜昌人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：臨床病理診斷。

【中圖分類號】R737.33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1008-8164(2016)01-0004-04

收稿日期：2015-11-02