骨髓基質干細胞在兔DBM上增殖作用的研究

劉培林，王慧建，劉霄龍，陳書愛，張建鋒濮陽市人民醫(yī)院骨科，河南濮陽　457000

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骨髓基質干細胞在兔DBM上增殖作用的研究

劉培林，王慧建，劉霄龍，陳書愛，張建鋒
濮陽市人民醫(yī)院骨科，河南濮陽457000

[摘要]目的分析骨髓機制干細胞在兔DBM上增殖作用。方法2014年3月—2015年7月，以3只大白兔為研究對象，根據Urist方法制備出DBM（同種脫鈣骨基質），測定光密度（OD）值，繪制增殖曲線，分析復合培養(yǎng)后最佳修復軟骨移植時機。結果SEM觀察呈現高密度空隙網架結構，平均孔隙率為（60.19±6.1）%；平均孔徑大小為（119.42±6.46）μm；兔DBM材料BMSCs體外復合培養(yǎng)后可見大量骨髓基質干細胞粘附，MTT法檢測復合培養(yǎng)6d骨髓基質干細胞增殖達到穩(wěn)定狀態(tài)。結論兔脫鈣骨基質具有三維網狀結構和良好的細胞相容性是一種較好的軟骨組織工程支架材料，最適合移植。

[關鍵詞]脫鈣骨基質；組織工程；支架材料；骨髓間充質干細胞

軟骨的再生和修復能力極其有限，一旦損傷很難自行修復，組織工程學位解決這一難題提供了新途徑[1]。種子細胞、支架材料等在組織工程中起到核心作用[2]，BMSCs是一種多功能細胞，在特定培養(yǎng)條件下可分化為成軟骨、成骨等多種細胞[3]，目前被認為屬于最佳種子細胞。為探討骨髓間充質干細胞與同種異體脫鈣骨基質共同培養(yǎng)，2014年3月—2015年7月以3只大白兔為研究對象，觀察BMSCs的生長情況及DBM的生物相容性，以兔為研究對象，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇成年新西蘭大白兔（新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物所中心）3只，雌雄不限，體重約12～15 kg。

主要試劑包括GIBCO公司提供L-DMEM、胎牛血清，主要儀器包括AMRESCO公司提供MTT、DMSO，美國OlympusIX71提供倒置相差顯微鏡，以及法國產飛利浦XL30ESEM提供掃描電鏡。

1.2DBM的制備

實驗嚴格依照《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。由市場購買家兔新鮮肩胛骨，取其松質骨，制備成圓餅形狀，乙醇浸泡30 min，風干后備用。

1.3BMSCs的分離和培養(yǎng)

取新西蘭大白兔3只經耳緣靜脈，戊巴比妥麻醉，雙側髂嵴脫毛。雙側髂嵴穿刺，抽取骨髓，加入LDMEM培養(yǎng)基，混勻后，培養(yǎng)24 h后換液，觀察其生長情況。原代細胞融合達到80%～90%，接種進入傳代培養(yǎng)，第3代細胞進行下一步試驗。

1.4DBM結構觀察

取6塊DBM，固定漂洗脫水，保存過夜，干燥，定向粘附于載物臺上觀察。

用掃描電鏡觀察DBM的表面結構。每個標本隨機取10幅照片，計算平均孔徑大?。↖mage J軟件的Measure功能）和孔隙率（CS6軟件的直方圖（histogram）功能）?？障睹娣e采用像素（Pixel）表示，孔隙率=（整個照片的像素-骨小梁占的像素）÷整個照片的像素[4]。

1.5BMSCs與DBM體外復合培養(yǎng)及掃描電鏡觀察

取DBM若干塊、再取6塊24孔培養(yǎng)板，分為2組，BMSCs為A組：各板放置DBM材料，第3代BMSCs接種于24孔培養(yǎng)板的預濕材料上。B組做空白對照試驗，每2 d更換液。觀察其生長變化。隨后分別在第2、4、6、8、12天時加入MTT 100 μL,測定各孔光密度（OD）值,并繪制生長曲線，電子顯微下觀察細胞粘附、增殖情況。

2　結果

2.1DBM的結構觀察

DBM支架材料肉眼可見呈現白色海綿狀，表面多孔，孔隙大小不一，相互連接，布滿網狀結果，軟件測定平均孔隙率為（60.19±6.1）%；平均孔徑大小為（119.42± 6.46）μm。

2.2倒置相差顯微鏡及SEM的觀察

倒置相差顯微鏡觀察可見A組1 h后細胞開始貼壁，48 h開始增殖。DBM周圍存在大量細胞，培養(yǎng)時間延長數量逐漸增多。SEM觀察，A組培養(yǎng)2 d DBM細胞大量生長，鋪滿表面，呈長梭形狀，培養(yǎng)6 d細胞明顯增多，細胞相互交叉重疊（圖1）。B組孔隙相互交通，呈現蜂窩孔隙狀結構（圖2）。

圖1　A組培養(yǎng)6 d時SEM觀察

圖2　B組培養(yǎng)6 d時SEM觀察

2.3繪制BMSCs在DBM上的生長曲線繪制

分別在第2、4、6、8、10、12天測定OD值，在培養(yǎng)6 d時，增殖穩(wěn)定，A組在6d達到最高，生長停滯，然后細胞強度下降，見表1。

表1　OD值變化

3　討論

BMSCs來源廣泛，體外培養(yǎng)時增殖能力強，一直被認為是軟骨組織工程有前途的種子細胞。DBM是目前研究的比較熱門的一種骨組織工程材料，大量研究結果證實DBM可應用于軟骨缺損修復。DBM是同種異體骨通過脫鈣、脫脂、處理得到，去掉了礦物質、脂質成分同時保留了骨基質中以骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）為主的具有誘導軟骨形成作用以及膠原[5]。

在組織工程中，種子細胞和復合體屬于核心環(huán)節(jié)，近幾年生物材料相容性研究中多采用體外細胞培養(yǎng)，檢測增殖情況方法[6]。培養(yǎng)BMSCs和支架材料體外復合體得到軟骨，復合時機是關鍵環(huán)節(jié)，時間過早，移植后容易被沖走，減少復合體數量。時間過晚，細胞活性大大降低，難以形成軟骨組織。形成生物材料復合物后，移植到缺損部位，形成有功能組織，達到修復組織效果。在該組分析中，采用掃描電鏡發(fā)現，DBM上細胞具有很好的伸展、增殖，細胞突起交錯，雖然DBM存在部分不足，但是不會影響細胞增長，符合軟骨工程支架材料要求。

該組制備DBM中參照Urist MR[7-8]試驗方法，通過檢測結果顯示孔隙相互交通，平均孔隙率為（60.19± 6.1）%；平均孔徑大小為（119.42±6.46）μm，能夠提供足

夠的內表面積和空間，有利于細胞增殖，并且具有一定的力學強度[9]。祝聯等人[10]在分析骨髓基質干細胞與珊瑚復合物體內移植時間中認為培養(yǎng)時間的延長會相應降低細胞功能。在該組分析中，測定種子細胞增殖穩(wěn)定狀態(tài)時間，結果表明A組DBM上在第6天時細胞增殖達高峰，所以我們認為第6天時是有利于軟骨缺損的最佳時機。

綜上，兔脫鈣骨基質具有三維網狀結構和良好的細胞相容性是一種較好的軟骨組織工程支架材料，DBM與BMSCs復合培養(yǎng)6d，BMSCs增殖達到穩(wěn)定，最適合移植。兔DBM支架材料解決了熱弄合成孔徑大小等問題，保持良好的生物相容性，具有很大應用前景，能夠為下一步關節(jié)腔內軟骨缺損移植和臨床提供研究依據。

[參考文獻]

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[8]Urist MR.Bone morphogenesis in implants of insoluble bone gelatin[J].Proe Nat Acad Sci USA,1973,70:3511-3526.

[9]聶芳菲，潘柏林，李健寧.脫細胞基質在軟骨組織工程中的應用[J].中國修復重建外科雜志，2009，23（4）:501-504.

[10]祝聯，周廣東，陳付國，等.骨髓基質干細胞與珊瑚復合物體內移植時間的研究[J].中華實驗外科雜志，2004，21（l: 10-13.

臨床醫(yī)學

Analysis of Value-added Function of Bone Marrow Stromal Stem Cells in Rabbit DBM

LIU Pei-lin,WANG Hui-jian,LIU Xiao-long,CHEN Shu-ai,ZHANG Jian-feng
Department of orthopedics,Puyang People's Hospital,Puyang,Henan Province,457000 China

[Abstract]Objective To analyze the value-added function of bone marrow stromal stem cells in rabbit DBM.Methods From March 2014 to July 2015,3 big white rabbits were selected as the research object,DBM（demineralized allogeneic bone matrix）was prepared according to the Urist method,the optical density（OD）value was detected,the value-added curve was drawn and the best repair cartilage transplantation after compound culture was analyzed.Results High density space truss structure was presented by SEM observation,the average porosity was（60.19±6.1）%and the average pore diameter size was（119.42±6.46）μm,a large number of bone marrow stromal stem cells adhesion was seen on the rabbit DBM materials after BMSCs compound culture in vitro,the value-added of bone marrow stromal stem cells?reached a steady state after 6d of compound culture by the detection of MTT method.Conclusion Rabbit DBM has a three-dimensional network structure and good cell compatibility,which is a good cartilage tissue engineering scaffold material and most suitable for transplantation.

[Key words]Decalcified bone matrix;Tissue engineering;Scaffold material;Bone marrow derived mesenchymal stem cell

[中圖分類號]R318.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2016）01（c）-0053-03

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.03.053

[作者簡介]劉培林（1968-），男，河南濮陽人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事骨科工作。

收稿日期：（2015-10-23）