五味子乙素對(duì)BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

吳念，陳亞瓊，陳曉，侯海燕，王華

?

五味子乙素對(duì)BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

吳念，陳亞瓊，陳曉，侯海燕，王華

【摘要】目的：研究五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）預(yù)防苯并芘（BaP）致人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR8-SVneo）損傷的作用機(jī)制。方法：通過(guò)新型四唑化合物（MTS）法觀察和測(cè)定，最終選取0.5，1，2 μmol/L Sch B分別作用HTR8-SVneo細(xì)胞24 h后再給予20 μmol/L Bap染毒處理24 h，MTS檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況；JC-1熒光染色法觀察各組線粒體膜電位熒光強(qiáng)度變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白（Bax）、細(xì)胞色素C （cytochromec，cyt-c）蛋白濃度；蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組的凋亡蛋白（Caspase-9）。結(jié)果：①BaP染毒組OD值為1.187±0.015，0.5，1，2 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)24 h后的OD值分別為1.483±0.022、1.489±0.048和1.531±0.240，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②BaP染毒組線粒體熒光強(qiáng)度弱，0.5，1，2 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)24 h后的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③BaP染毒組Bax、cyt-c蛋白濃度升高，0.5，1，2 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)24 h后細(xì)胞內(nèi)Bax、cyt-c蛋白濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。④BaP染毒組細(xì)胞內(nèi)caspase-9蛋白表達(dá)升高，0.5，1，2 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)24 h后細(xì)胞內(nèi)caspase-9蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Sch B可以預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抗線粒體途徑有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】五味子乙素；苯并芘；人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞；線粒體；細(xì)胞色素C

作者單位：570203武警海南總隊(duì)醫(yī)院婦產(chǎn)科（吳念）；中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（陳亞瓊，陳曉，侯海燕，王華）

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：45-48）

多環(huán)芳烴是常見(jiàn)的空氣污染物，主要來(lái)自于煙草煙霧、煤炭燃燒、汽車尾氣和烹調(diào)油煙，容易在水體、土壤和作物中殘留蓄積[1]。苯并芘（BaP）是多環(huán)芳烴中最有代表性的污染物，有研究發(fā)現(xiàn)，BaP與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，如流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限及畸形等，還和生育能力下降、不孕不育有關(guān)[2-3]，其可能的作用機(jī)制包括影響了細(xì)胞色素P450酶的代謝，參與氧化損傷、細(xì)胞凋亡及DNA損傷等[4-6]。五味子（北五味子）性酸味溫，具有滋腎、止瀉、斂肺、寧心、澀精、安神等功效，其主要成分Sch B不僅具有抗氧化抗凋亡功能[7-8]，還具有體外抑菌[8]、抗DNA損傷[9]等作用。Sch B可以降低某些藥物的毒性和預(yù)防相關(guān)的疾病，如Sch B可以預(yù)防和治療阿霉素誘導(dǎo)的急性心肌病[10]，削弱血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）遷移和血管纖維化[11]，但Sch B在空氣污染物致胚胎損傷的預(yù)防作用研究尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以HTR8-SVneo為載體，構(gòu)建BaP損傷模型，探討Sch B預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器胎牛血清、胰蛋白酶（Gibcol公司），RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibcol公司）。Sch B（中國(guó)藥品生物制品鑒定所），BaP（日本TCI公司）；新型四唑化合物（MTS，美國(guó)Promega公司），線粒體膜電位試劑盒（天津碧云天生物有限公司），RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），cyt-c、Bax酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海拜沃公司），Caspase-9（Abcam公司），人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo由加拿大Graham Professor惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HTR8-SVneo細(xì)胞接種于用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI-1640的培養(yǎng)液于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTS檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞104個(gè)/mL接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)，分5組。對(duì)照組：不給予任何處理；BaP染毒組：BaP染毒24 h組；Sch B低劑量組：0.5 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B中劑量組：1 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B高劑量組：2 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）。先將MTS與培養(yǎng)基按照1∶5的比例配置好，吸棄96孔板培養(yǎng)基，每孔加入120 μL MTS溶液，并設(shè)有調(diào)零組，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)2.5 h；然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm條件下的光密度值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3JC-1試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位細(xì)胞按105個(gè)/mL種植于6孔板，每組細(xì)胞處理同上，收集并用PBS溶液洗滌，按照線粒體膜電位試劑盒說(shuō)明書(shū)，用配置好的JC-1染色工作液對(duì)細(xì)胞染色置于室溫37℃孵育20 min，待孵育結(jié)束后吸棄上清，并用JC-1染色緩沖液洗滌2遍，再加入2 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察拍照，IPP軟件分析熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位下降或喪失時(shí)，JC-1只能形成單體產(chǎn)生綠色熒光。因此可以通過(guò)紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來(lái)衡量線粒體的去極化程度。

1.2.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cyt-c、Bax濃度cyt-c一般存在于線粒體內(nèi)，當(dāng)Bcl-2家族中的Bax升高時(shí)，cyt-c就會(huì)從線粒體中釋放到胞漿中。細(xì)胞按105個(gè)/mL種植于6孔板，每組細(xì)胞處理同上，收集細(xì)胞，然后反復(fù)凍融，使細(xì)胞膜破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)成分。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)cyt-c、Bax的吸光度值，依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)每個(gè)待測(cè)樣品的OD值算出對(duì)應(yīng)的蛋白濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blotting檢測(cè)各組的Caspase-9蛋白的表達(dá)細(xì)胞按105個(gè)/mL種植于6孔板，每組細(xì)胞處理同上，收集細(xì)胞，提取蛋白，通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組的蛋白濃度，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，膜在室溫下用封閉液封閉1 h，Caspase-9稀釋抗體（1∶2 500）和βactin稀釋抗體（1∶1 000），過(guò)夜，洗膜后加入封閉液稀釋的二抗稀釋液（1∶3 500），室溫2 h。用ECL solution顯色，最后進(jìn)行顯影，定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞的細(xì)胞活性和膜電位變化BaP染毒組細(xì)胞活性低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Sch B低、中、高劑量組細(xì)胞活性均高于BaP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。BaP染毒組線粒體熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Sch B低、中、高劑量組均高于BaP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖1（見(jiàn)后插一）。

表1　各組HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)OD值及線粒體熒光強(qiáng)度（±s）

表1　各組HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)OD值及線粒體熒光強(qiáng)度（±s）

組別　n　OD值　線粒體熒光強(qiáng)度對(duì)照組①　3　1.568±0.012　10.213±2.366 BaP染毒組②　3　1.187±0.015*　3.347±0.855* t（P）　34.078（＜0.05）　4.728（＜0.05）SchB低劑量組③　3　1.483±0.022**　6.993±0.532** SchB中劑量組④　3　1.489±0.048**　7.150±1.216** SchB高劑量組⑤　3　1.531±0.240**　8.728±1.046** F（P）　84.714（0.000）　17.354（0.000）

2.2各組細(xì)胞內(nèi)cyt-c、Bax蛋白濃度BaP染毒組Bax、cyt-c蛋白濃度高于對(duì)照組。Sch B低、中、高劑量組Bax蛋白濃度低于BaP染毒組，cyt-c均低于BaP染毒組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2　各組HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)Bax及cyt-c蛋白濃度（±s）

表2　各組HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)Bax及cyt-c蛋白濃度（±s）

組別　n　Bax蛋白濃度　cyt-c蛋白濃度對(duì)照組①　3　166.342±0.368　1.741±0.229 BaP染毒組②　3　231.818±3.246*　2.317±0.036* t（P）　34.716（＜0.05）　4.318（＜0.05）Sch B低劑量組③　3　204.559±1.476**　2.068±0.097** Sch B中劑量組④　3　191.578±2.622**　1.863±0.062** Sch B高劑量組⑤　3　184.442±2.349**　1.802±0.071** F（P）　208.328（0.000）　33.204（0.000）

2.3各組細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)BaP染毒組Caspase-9蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低，Sch B低、中、高劑量組Caspase-9蛋白表達(dá)均高于BaP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2和表3。

圖2　Western blotting法檢測(cè)5組細(xì)胞中Caspase-9蛋白的表達(dá)

表3　各組HTR8-SVneo細(xì)胞中Caspase-9蛋白的表達(dá)

3　討論

胚胎停育是自然流產(chǎn)的一種特殊類型，與妊娠中期流產(chǎn)不同，多在胚胎尚未形成的時(shí)候就停止了發(fā)育。造成胚胎停育的原因有很多，主要與精子問(wèn)題、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫功能異常、生殖道感染、子宮異常和環(huán)境因素等有關(guān)，但仍有約50%的病因不明。目前已有研究證實(shí)胚胎停育可能與絨毛細(xì)胞有關(guān)，查斌斌等[12]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)絨毛細(xì)胞染色體異常是胚胎停育的主要原因。在眾多影響因素中，環(huán)境空氣污染問(wèn)題與人類生存繁殖是密切相關(guān)的，因此環(huán)境因素對(duì)胚胎發(fā)育的影響越來(lái)越受到人們的重視。

有研究表明環(huán)境空氣污染物與不良妊娠結(jié)局如早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量和宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等有關(guān)。研究認(rèn)為在胎兒生長(zhǎng)的重要時(shí)期，空氣污染物穿過(guò)胎盤對(duì)生長(zhǎng)胎兒的分裂細(xì)胞造成不可挽回的損害，低氧損傷或免疫調(diào)節(jié)損傷是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的可能機(jī)制，其中死胎的危險(xiǎn)與早期妊娠周圍二氧化氮和二氧化硫濃度以及妊娠后期二氧化硫和一氧化碳濃度的增加有關(guān)[13]。而在分娩前空氣污染物濃度短期增加可能會(huì)觸發(fā)死胎[14]。由此可見(jiàn)，在胚胎發(fā)育的初期，空氣污染物對(duì)妊娠的不良結(jié)局有一定的影響。前期研究已經(jīng)證實(shí)，胚胎停育的孕婦外周血BaP DNA加合物的濃度明顯高于正常妊娠的孕婦，認(rèn)為妊娠早期接觸BaP是胚胎停育的危險(xiǎn)因素[15]。此外，本研究還證實(shí)了Sch B對(duì)BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用[16]，但Sch B是否可以通過(guò)其他作用途徑預(yù)防損傷還有待進(jìn)一步研究。有報(bào)道Sch B可以通過(guò)下調(diào)促凋亡蛋白基因降低Caspase-3的活性，發(fā)揮抗凋亡作用[17]；雖然近期對(duì)Sch B保護(hù)作用的相關(guān)研究很多，但Sch B對(duì)BaP致胚胎損傷的預(yù)防作用途徑研究尚少見(jiàn)報(bào)道，因此筆者從Sch B抗凋亡作用進(jìn)行初步探討，試圖解釋Sch B對(duì)BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。

生物體內(nèi)的各種組織細(xì)胞通過(guò)增殖和凋亡來(lái)維持?jǐn)?shù)量平衡，細(xì)胞凋亡的通路主要是死亡受體通路和線粒體通路。BaP與結(jié)合在線粒體外膜或存在于胞漿中的Bcl-2成員Bak、Bax等相互作用，導(dǎo)致后者寡聚并插入線粒體膜，引起線粒體膜的通透性改變，跨膜電位丟失，從而釋放出cyt-c。釋放的cyt-c與凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1）及Caspase-9形成多聚復(fù)合體，并且使其自我剪切活化，再激活下游的Caspase家族，完成其相應(yīng)底物的剪切，最終引起細(xì)胞凋亡[18]。本研究證實(shí)Sch B可以抗線粒體通路預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞的損傷，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白的濃度，進(jìn)而抑制下游凋亡信號(hào)Caspase-9的激活，達(dá)到預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞的損傷作用。研究從線粒體通路探討了Sch B預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，對(duì)闡明中藥抗多環(huán)芳香烴環(huán)境污染物生殖毒性和開(kāi)發(fā)預(yù)防不良妊娠結(jié)局的天然藥物提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Rubio-Clemente A，Torr es-Palma RA，Pe?uela GA.Removal ofpolycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous environment by chemical treatments：a review[J].Sci Total Environ，2014，478：201-225.

[2]Bobak M.Outdoor air pollution，low birth weight，and prematurity[J]. Environ Health Perspect，2000，108（2）：173-176.

[3]Wu J，Hou H，Ritz B，et al.Exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons and missed abortion in early pregnancy in a Chinese population[J].Sci Total Environ，2010，408（11）：2312-2318.

[4]WassenbergDM，DiGiulioRT.Synergisticembryotoxicityof polycyclic aromatic hydrocarbon aryl hydrocarbon receptor agonists with cytochrome P4501A inhibitors in Fundulus heteroclitus[J]. Environ Health Perspect，2004，112（17）：1658-1664.

[5]Detmar J，Rabaglino T，Taniuchi Y，et al.Embryonic loss due to exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons is mediated by Bax[J]. Apoptosis，2006，11（8）：1413-1425.

[6]Singh R，Sram RJ，Binkova B，et al.The relationship between biomarkersofoxidativeDNAdamage，polycyclicaromatic hydrocarbonDNAadducts，antioxidantstatusandgenetic susceptibility following exposure to environmental air pollution in humans[J].Mutat Res，2007，620（1/2）：83-92.

[7]Chiu PY，Lam PY，Yan CW，et al.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts[J]. Fitoterapia，2011，82（4）：682-691.

[8]商紅軍，孟憲軍，李斌，等.北五味子乙素體外抗氧化及抑菌作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（2）：170-173.

[9]Tatewaki N，Nishida H，Yoshida M，et al.Differential effect of schisandrin B stereoisomers on ATR-mediated DNA damage checkpoint signaling[J].J Pharmacol Sci，2013，122（2）：138-148.

[10]胡開(kāi)永,楊勇,何莉華,等.五味子乙素和右丙亞胺對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,49（7）:1007-1012.

[11]Chun JN，Kim SY，Park EJ，et al.Schisandrin B suppresses TGFβ1-induced stress fiber formation by inhibiting myosin light chain phosphorylation[J].J Ethnopharmacol，2014，152（2）：364-371.

[12]查斌斌，馮燕.195例胚胎停育絨毛組織細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J].社會(huì)醫(yī)學(xué)雜志，2012，10（6）：11-12.

[13]Faiz AS，Rhoads GG，Demissie K，et al.Ambient air pollution and the risk of stillbirth[J].Am J Epidemiol，2012，176（4）：308-316.

[14]Faiz AS，Rhoads GG，Demissie K，et al.Does ambient air pollution trigger stillbirth[J].Epidemiology，2013，24（4）：538-544.

[15]侯海燕，陳亞瓊.母親外周血BaP-DNA加合物與孕早期胚胎停育的關(guān)系[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18（2）：81-85.

[16]章艷燕，陳亞瓊.Sch B對(duì)BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2015，34（3）：181-183.

[17]Wang B，Wang XM.Schisandrin B protects rat cortical neurons against A142-induced neurotoxicity[J].Pharmazie，2009，64（7）：450-454.

[18]Cory S，Adams JM.The Bcl2 family：regulators of the cellular lifeor-death switch[J].Nat Rev Cancer，2002，2（9）：647-656.

[本文編輯李淑杰]

·短篇論著·

The Protection Effect and Mechanism of Schisandrin B on Extravillous Trophoblast Cell Line Damage Caused by BaP

WU Nian，CHEN Ya-qiong，CHEN Xiao，HOU Hai-yan，WANG Hua.Department of Obstetrics and Gynecology，Hainan Provincia Corps Hospital，Chinese People′s Armed Police Forces，Haikou 570203，China（WU Nian）；Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（CHEN Yaqiong，CHEN Xiao，HOU Hai-yan，WANG Hua）
Corresponding author：CHEN Ya-qiong，E-mail：chenyq82@gmail.com

【Abstract】Objective：To explore the protection mechanism of Schisandrin B on extravillous trophoblast cell line damage caused by BaP.Methods：After 0.5，1，2 μmol/L Sch B deal with human HTR8-SVneo cells 24 h，added 20 μmol/L Bap 24 h，using MTS measured cells growth.Used JC-1 fluorescent staining to measure the change of mitochondrial membrane potential in each group.Respectively used ELISA to measure the concentration of Bax and cyt-c protein in each group.Respectively used Western blotting to analyse the expression of caspase-9 in each group.Results：①M(fèi)TS results showed that BaP alone cell OD was 1.187±0.015，0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of OD was 1.483±0.022，1.489±0.048 and 1.531±0.240，compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.②JC-1 fluorescent staining results showed that BaP alone cell mitochondrial fluorescent intensity was lower and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of mitochondrial fluorescent intensity was higer.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.③ELISA results showed that BaP alone cell the concentration of Bax，cyt-c protein were higher and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of the concentration of Bax，cyt-c protein were lower，respectively.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.④Western blotting results showed that BaP alone cell the concentration of caspase-9 protein was higer，and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of the concentration of caspase-9 protein was lower，respectively.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusions：Schisandrin B can prevent damage of extravillous trophoblast cell line caused by BaP，whose mechanism may be associated with resistance to mitochondrial pathway.

【Keywords】Schisandrin B；BaP；Extravillous trophoblast cell；Mitochondria；Cyt-cl

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273977/H2902）；天津市自然科學(xué)基金一般項(xiàng)目（12JCYBJC16200）

通信作者：陳亞瓊，E-mail：chenyq82@gmail.com

收稿日期：（2015-07-28）