精子DNA損傷對(duì)IVF/ICSI-ET結(jié)局影響的回顧性資料分析

邵淑敏　李　姣　鄒　敏　胡　廉　張　玲

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所生殖醫(yī)學(xué)中心(武漢,430030)

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·臨床研究·

精子DNA損傷對(duì)IVF/ICSI-ET結(jié)局影響的回顧性資料分析

邵淑敏李姣鄒敏胡廉張玲*

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所生殖醫(yī)學(xué)中心(武漢,430030)

摘要目的：探討精子DNA損傷對(duì)體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)結(jié)局的影響。方法：回顧性分析了初次行常規(guī)IVF和ICSI治療的192例不孕夫婦的臨床資料。分別比較行IVF和ICSI治療時(shí)，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)≤15%和DFI>15%的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率的差異；并比較DFI>15%時(shí)，不同受精方式(IVF或ICSI)對(duì)受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率的影響。結(jié)果：在IVF或ICSI治療周期中，精子DNA損傷對(duì)受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無(wú)影響(P>0.05)。在DFI>15%情況下，行IVF治療的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率與行ICSI治療比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：精子DNA損傷不影響IVF/ICSI-ET的結(jié)局。對(duì)于DFI>15%的患者ICSI-ET與IVF-ET的治療結(jié)局相似。

關(guān)鍵詞體外受精-胚胎移植；精子DNA損傷；流產(chǎn)率

體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)使生育力低或不孕患者獲得了生育的可能，尤其是卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)使越來(lái)越多男性不育癥患者獲得后代。然而，研究證實(shí)男性不育患者的精子核可能存在潛在異常，精子形態(tài)完整性也與精子DNA完整性不一致，ICSI時(shí)人為選擇形態(tài)和活力好的精子并不能確保其遺傳物質(zhì)正常[1]。目前精子DNA損傷成為對(duì)精子功能評(píng)價(jià)的一項(xiàng)新指標(biāo)，有研究表明精子DNA損傷對(duì)IVF-ET結(jié)局有一定的影響，但目前尚存爭(zhēng)議[2]。本研究回顧性分析行IVF/ICSI-ET治療的不孕夫婦臨床資料，探討精子DNA損傷對(duì)IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析本中心初次行IVF/ICSI治療的192對(duì)不孕夫婦的臨床資料，其中IVF治療周期114個(gè)，ICSI治療周期78個(gè)。納入條件：①女方年齡≤35歲；②月經(jīng)規(guī)律，卵巢功能正常；③獲卵數(shù)≥5枚；④確診為盆腔因素或輸卵管因素不孕，排除子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 IVF/ICSI方案女方超排卵均采用常規(guī)長(zhǎng)方案，月經(jīng)周期第21天開(kāi)始皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-α，達(dá)菲林) 0.1 mg/d，持續(xù)14 d。若卵泡刺激素(FSH)< 5 U/L，黃體生成素(LH)< 3 U/L，雌二醇(E2)< 183 pmol/L，雙側(cè)卵巢竇卵泡直徑≤5 mm，子宮內(nèi)膜<5 mm，即可啟動(dòng)促性腺激素(Gn)，啟動(dòng)Gn后持續(xù)皮下注射GnRH-0.05 mg/d，直至絨毛膜促性腺激素(hCG)注射日。啟動(dòng)Gn后第5天開(kāi)始B超檢測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)卵泡達(dá)18～20 mm，根據(jù)血清LH、P水平?jīng)Q定當(dāng)晚是否肌注hCG 10000 U ，hCG肌注后36～37 h在陰道B超引導(dǎo)下取卵。

1.2.3 精液DNA完整性檢測(cè)手淫法取精后1 h內(nèi)取50 μl精液于EP管中，-80℃冰箱中冷凍保存。將冷凍的精液樣品迅速置于37℃水浴中復(fù)蘇。用冷TNE緩沖液(0.01 mol/L Tris HCl, 0.15 mol/L NaCl, 1 mol/L EDTA, pH 7.4)稀釋精子濃度為2×106/ml；取50 μl加入進(jìn)樣管中，加入100 μl酸處理液(0.1% Triton X-100, 0.15mol/L NaCl, 0.08 mol/L HCl, pH 1.2)，振蕩混勻30 s，加300 μl AO染液染色2 min后，低速流動(dòng)樣品，檢查精子流速，控制流速200～300個(gè)精子/s，每份精液樣本獲取10 000個(gè)精子的紅綠熒光。DNA完整性好，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)≤15%；DNA完整性中等，15%27%。

1.2.4 分組根據(jù)DFI檢測(cè)值將192對(duì)患者夫婦分為DFI≤15%和DFI>15%兩個(gè)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

符合納入條件的192對(duì)夫婦，其中IVF-ET 114個(gè)周期：DFI≤15% 70個(gè)周期(DFI≤15%組)，DFI>15% 44個(gè)周期(DFI>15%組)；ICSI-ET 78個(gè)周期：DFI≤15% 27個(gè)周期(DFI≤15%組)，DFI>15% 51個(gè)周期(DFI>15%組)。ICSI周期與IVF周期中DFI≤15%組與DFI>15%組對(duì)象一般情況均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 不同DFI組IVF-ET和ICSI-ET結(jié)局比較

IVF-ET周期中，DFI≤15%組和DFI>15%組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ICSI-ET周期中，DFI>15%組與DFI≤15%組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 精子DFI>15%患者不同受精方式的結(jié)局

精子DFI>15% 患者行IVF和ICSI治療的女方年齡、男方年齡、女方FSH水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，IVF組的精子濃度和精子活力明顯高于ICSI組(P<0.05)。IVF組與ICSI組受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表1　IVF-ET和ICSI-ET周期中不同DFI對(duì)象的一般情況比較

表2　不同DFI組IVF-ET和ICSI-ET結(jié)局比較

表3　DFI>15%患者不同受精方式治療情況比較

3 討論

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而獨(dú)特的過(guò)程，涉及一系列有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程，精子形成過(guò)程中組蛋白逐漸被過(guò)渡蛋白，最終被魚精蛋白代替。魚精蛋白能中和DNA電荷，降低DNA分子間靜電作用，精子DNA與魚精蛋白通過(guò)二硫鍵的交聯(lián)形成致密胞核，抵抗精子DNA在女性生殖道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的破壞，保證遺傳物質(zhì)的完整性，并將父系遺傳信息完整地傳遞給卵母細(xì)胞，并在胚胎發(fā)育中正確地表達(dá)[3]。某些環(huán)境因素、病理性因素和醫(yī)源性損傷等通過(guò)精子染色質(zhì)組裝、氧化應(yīng)激、精子凋亡等機(jī)制造成精子DNA損傷[4]。精子DNA損傷主要有DNA碎片增加，包括精子DNA雙鏈或單鏈的卵裂、異常染色質(zhì)包裝及魚精蛋白缺乏等形式[5]。

精子DNA損傷與男性不育有密切關(guān)系。男性不育癥患者的精子DNA損傷水平顯著高于生育力正常男性[6]，隨著精子DNA碎片的增加，精子頂體酶活性和精子穿透透明帶與卵黃膜融合的能力逐漸降低，影響受精率[7]。然而有些使用連續(xù)順序追蹤超聲檢查法檢測(cè)精子DNA完整性的研究顯示，精子DNA完整性與精子受精率無(wú)顯著相關(guān)性[8]。本研究嚴(yán)格篩選單純輸卵管性因素不孕，年齡≤35歲，卵巢功能正常，獲卵數(shù)≥5枚卵子的患者夫婦為研究對(duì)象。精子DNA完整性檢測(cè)是男方患者病因診斷的精液質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目，本研究中男方患者精液均進(jìn)行精子DNA損傷檢測(cè)。本研究結(jié)果證實(shí)，無(wú)論是IVF還是ICSI，精子DNA損傷均不影響卵子的受精率，而且當(dāng)DFI>15%時(shí)，IVF和ICSI受精率仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡苁且?yàn)榕咛グl(fā)育最初僅受母源基因組調(diào)控，受精和胚胎早期發(fā)育都依賴于卵子本身的質(zhì)量[9]，而精子DNA是著床前胚胎發(fā)育的后期才開(kāi)始表達(dá)，所以精子DNA對(duì)卵子受精的影響不大[10]。

本研究結(jié)果還顯示，在IVF和ICSI周期中，精子DFI與對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無(wú)顯著影響。有研究顯示，無(wú)論是IVF組還是ICSI組，低DNA損傷組(DFI<30%)和高DNA損傷組(DFI≥50%)的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]，雖然在胚胎發(fā)育后期，父源基因組逐漸被激活，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育，但是胚胎自身可能也對(duì)精子DNA進(jìn)行修復(fù)，干預(yù)精子DNA完整性對(duì)治療結(jié)局的影響。Zhang等[12]研究也認(rèn)為精子DNA損傷對(duì)IVF或ICSI的流產(chǎn)率沒(méi)有影響，但是有研究則認(rèn)為精子DNA損傷與囊胚獲得率呈負(fù)相關(guān)，且影響胚胎的繼續(xù)發(fā)育[13]。研究證實(shí)射線可使大鼠精子DNA有一定程度的氧化性損傷，卵子受精后，胚胎發(fā)育明顯受阻，甚至胚胎停止發(fā)育，死于子宮內(nèi)[14]。精子DNA碎片化會(huì)使精子在核染色體解凝聚過(guò)程中改變表觀遺傳，從而影響精子的功能，進(jìn)而對(duì)著床后胚胎的發(fā)育和妊娠結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響[15-16]。不同結(jié)論可能與研究過(guò)程中精子DNA完整性的檢測(cè)方法以及臨界值的確定、樣本的大小等差異有關(guān)。

本研究比較了精子DFI>15%患者不同受精方式的結(jié)局，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IVF組與ICSI組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與Frydman[10]的研究結(jié)果一致。對(duì)于精子DNA損傷多的患者，ICSI治療并不能改變其妊娠結(jié)局。

由于本研究中精子DFI>15%同時(shí)又滿足納入條件的不孕患者較少，故結(jié)論有一定的局限性，仍需更多的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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[責(zé)任編輯：張璐]

Study on sperm DNA fragmentation effecting on the outcomes of In Vitro Fertilization and Embryo Transfer

SHAO Shumin, LI Jiao, ZOU Min, HU Lian, ZHANG Ling*

FamilyPlanningResearchInstitute&CenterforReproductiveMedicineofTongJiMedicalCollege,HuangZhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

AbstractObjective: To assess sperm DNA fragmentation effecting on the outcomes of In Vitro Fertilization (IVF) and Embryo Transfer (ET). Methods: Retrospective analysis 192 couples who accepted IVF/ Intracytoplasmic sperm injection(ICSI)and ET. According to the DNA fragmentation index (DFI), the cases were divided into DFI≤15% group(low DFI group) and DFI>15% group(high DFI group). When patients were treated by IVF or ICSI, comparisons were made between high DFI group and low DFI group in the fertilization rate, embryo quality, rate of implantation, rate of clinical pregnancy and rate of abortion. In high DFI group, comparisons were also made between IVF and ICSI in the fertilization rate, embryo quality, and rate of clinical pregnancy rate. Results: During patients were treated by IVF or ICSI, no significant correlation of sperm DFI with fertilization rate, embryo quality, rate of clinical pregnancy and rate of implantation and rate of abortion (P>0.05). There was no significant difference when IVF compared to ICSI in the fertilization rate, embryo quality, and rate of clinical pregnancy rate (P>0.05). Conclusion: The sperm DNA fragmentation has no any effect on the outcomes of IVF/ ICSI and ET. As for patients with DFI≤15%, the outcome are similar when treated by IVF or ICSI .

Key wordsIn Vitro Fertilization; Embryo Transfer; Sperm DNA fragmentation; Rate of abortion

收稿日期：2015-07-09修回日期：2016-01-22

*通訊作者：zhling312@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.03

*Corresponding author:ZHANG Ling, Email: zhling312@163.com