囊胚冷凍保存時間對復(fù)蘇移植臨床結(jié)局的影響

王雪，甄璟然，孫正怡，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必，何方方

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京　100730)

·臨床研究·

囊胚冷凍保存時間對復(fù)蘇移植臨床結(jié)局的影響

王雪，甄璟然，孫正怡*，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必，何方方

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京100730)

【摘要】目的分析冷凍保存時間對復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量的影響，進(jìn)一步探討長期胚胎冷凍保存是否對臨床結(jié)局產(chǎn)生影響。方法回顧性分析2005年12月至2015年1月在我院輔助生殖中心進(jìn)行復(fù)蘇囊胚移植患者的臨床資料。按照復(fù)蘇前囊胚的冷凍保存時間將1 808個移植周期分為7組，第1組為≤90 d、第2組為91～180 d、第3組為181～360 d、第4組為361～720 d、第5組為721～1 080 d、第6組為1 081～1 440 d、第7組為≥1 441 d。比較7組的復(fù)蘇后存活率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率以及各組間單胎的新生兒出生結(jié)局。結(jié)果7組間胚胎存活率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；7組間的單胎新生兒出生結(jié)局比較亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論本研究提示胚胎長期冷凍保存對凍融胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛力影響不大，但囊胚長期冷凍保存的遠(yuǎn)期安全性還有待于進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】凍融胚胎移植；冷凍保存時間；種植率；臨床妊娠率；活產(chǎn)率

Objective： To analyze the effect of cryopreservation storage time on embryo quality after frozen-thawed and clinical pregnancy outcome.

Methods： The data of 1 808 transfer cycles with frozen-thawed blastocysts in our productive center from December 2005 to January 2015 were retrospectively analyzed. The patients were divided into 7 groups according to the cryopreservation storage time：group 1(≤90 days)；group 2 (91-180 days)；group 3 (181-360 days)；group 4 (361-720 days)；group 5 (721-1 080 days)；group 6 (1 081-1 440 days)；group 7(≥1 441 days). And then the survival rate，implantation rate，pregnancy rate and live birth rate were compared among the seven groups.

Results： The storage time did not significantly affect embryo survival rate. There were no significant differences in implantation rate，pregnancy rate，abortion rate and live birth rate among the seven groups (all P>0.05). The outcomes of single fetus newborn were also not significantly different(P>0.05).

Conclusions： The study results indicate that the cryopreservation storage time do not affect embryo quality and embryo developmental potential. More studies are needed to evaluate the safety of long-term cryopreservation.

Key words： Frozen-thawed embryo transfer；Cryopreservation storage time；Implantation rate；Pregnancy rate；Live birth rate

(J Reprod Med 2016，25(5)：389-394)

自1983年第一例人類冷凍胚胎成功臨床妊娠后，人類胚胎冷凍保存技術(shù)迅速發(fā)展并廣泛地被世界各地的輔助生殖中心接受，成為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。胚胎凍融移植能夠降低卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生率，并可通過控制移植胚胎數(shù)而減少多胎發(fā)生，由此可提高治療的安全性；同時還能提供多次胚胎移植機(jī)會，從而提高一次取卵周期的累積妊娠率，降低患者治療費用。近年來隨著卵巢超排卵方案和實驗室技術(shù)的改善，以及對生育力保護(hù)的強(qiáng)調(diào)，冷凍胚胎的數(shù)量不斷增加。大量胚胎被冷凍保存數(shù)年，就引起了人們對于儲存時間對胚胎活力和隨后種植能力的影響的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)胚胎冷凍保存時間不會影響胚胎質(zhì)量[1-3]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎冷凍保存幾個月后，胚胎的細(xì)胞死亡增加[4-5]。目前關(guān)于囊胚玻璃化冷凍的保存時間與臨床結(jié)局相關(guān)的數(shù)據(jù)較少，因此本研究將分析不同冷凍保存時間對復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量的影響，進(jìn)一步探討長期胚胎冷凍保存是否對臨床結(jié)局產(chǎn)生影響。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2005年12月至2015年1月在北京協(xié)和醫(yī)院輔助生殖中心進(jìn)行復(fù)蘇囊胚移植患者的臨床資料。所有囊胚均采用玻璃化方法進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇。

納入標(biāo)準(zhǔn)：新鮮周期的不育原因為輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌癥、男方因素、排卵障礙(包括多囊卵巢綜合征等)、不明原因不育。

共收集1 811個復(fù)蘇周期，其中3例因為移植日胚胎質(zhì)量差放棄移植，因此可納入分析的周期數(shù)為1 808個。按照復(fù)蘇前囊胚的冷凍保存時間分為7組，第1組為≤90 d、第2組為91～180 d、第3組為181～360 d、第4組為361～720 d、第5組為721～1 080 d、第6組為1 081～1 440 d、第7組為≥1 441 d。

二、研究方法

1. 囊胚培養(yǎng)及質(zhì)量評價：取卵周期采用本中心常規(guī)方案進(jìn)行超促排卵，獲卵后根據(jù)患者情況采用體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，取卵24 h后觀察受精情況，72 h觀察卵裂球胚胎情況，根據(jù)胚胎評分情況決定移植；移植后剩余胚胎經(jīng)患者知情同意后全部行囊胚培養(yǎng)，在受精后第5日或第6日分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)，采用Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進(jìn)行評分。首先根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度分為1～6期，然后對4～6期的囊胚進(jìn)一步根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(TE)表現(xiàn)評為A～C級。

2. 囊胚冷凍：鑒于先前發(fā)現(xiàn)早期囊胚及孵出的囊胚冷凍后復(fù)蘇率不甚理想[6]，故而本中心均在囊胚發(fā)育至4期時選取內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量A或B級的囊胚凍存，C級者放棄，而滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量不限。

本中心全部采用玻璃化冷凍方法進(jìn)行胚胎冷凍。具體方法如以往文章所述[7-8]。囊胚冷凍之前進(jìn)行人工皺縮，然后將囊胚放入含有7.5%(v/v)DMSO和7.5%(v/v)乙二醇的預(yù)平衡液中平衡2 min，之后將胚胎轉(zhuǎn)移入玻璃化冷凍液[15%(v/v)DMSO+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml Ficoll]中平衡30 s，將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍環(huán)(cryoloop環(huán))上，直接浸入液氮保存。

3. 胚胎復(fù)蘇：于移植當(dāng)天進(jìn)行。囊胚復(fù)蘇之前，在胚胎培養(yǎng)皿內(nèi)分別配制復(fù)蘇液：0.33 mol/L蔗糖溶液、0.2 mol/L蔗糖溶液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)；將載有囊胚的冷凍環(huán)從液氮中取出，空氣中停留5 s后直接將胚胎依次浸入上述復(fù)蘇液中，時間分別為2 min、3 min和5 min；復(fù)蘇后囊胚在遠(yuǎn)離細(xì)胞團(tuán)的透明帶上部位激光切割透明帶1/4左右行輔助孵化；將囊胚移入預(yù)先配制的囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中，于37℃、6% CO2和5% O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。囊胚腔重新擴(kuò)張者判斷為囊胚存活。

4. 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植：內(nèi)膜準(zhǔn)備方法分為兩種：(1)自然周期法：用于月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正常的患者，在排卵前注射HCG 2 000 U(艾澤，默克-雪蘭諾，德國)，于超聲監(jiān)測到卵泡破裂后開始黃體支持，肌注黃體酮(浙江仙琚)20～40 mg/d，在排卵后第6日移植胚胎。(2)人工周期法：月經(jīng)第2～4日常規(guī)B超檢查，口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，先靈，德國)，根據(jù)患者既往內(nèi)膜情況，選擇不同起始劑量(2～18 mg/d)。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時肌注黃體酮(20 mg×2 d、40 mg×2 d、20～40 mg×1 d)，肌注黃體酮后第6日在B超引導(dǎo)下行囊胚復(fù)蘇移植，每周期移植1～2枚胚胎。移植后常規(guī)肌注黃體酮行黃體支持。

5. 妊娠結(jié)局判斷：移植后第7日測血清HCG>5 U/L判定為生化妊娠，移植后4周超聲檢查見胎心和胎囊則為臨床妊娠。種植率：B超下妊娠囊總數(shù)占移植囊胚總數(shù)的百分比；早期妊娠丟失率：移植后第7日判定為生化妊娠而之后超聲未見胎囊者的例數(shù)與復(fù)蘇移植周期總例數(shù)的百分比；臨床妊娠率：臨床妊娠總例數(shù)與復(fù)蘇移植周期總例數(shù)的百分比；流產(chǎn)率：妊娠過程中流產(chǎn)的例數(shù)占臨床妊娠總例數(shù)的百分比；活產(chǎn)率：隨訪獲得活產(chǎn)的總例數(shù)與復(fù)蘇移植周期總例數(shù)的百分比。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較進(jìn)行卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、總體情況

本研究共收集1 811個復(fù)蘇周期，其中3例因為移植日胚胎質(zhì)量差放棄移植，因此可納入分析的周期數(shù)為1 808個。復(fù)蘇胚胎3 368個，存活3 238個，存活率為96.1%。平均移植胚胎數(shù)為(1.79±0.42)個。超聲下見到妊娠囊1 483個，種植率為45.7%(1 483/3 242)；1 096例患者獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為60.6%(1 096/1 808)；妊娠后流產(chǎn)115例，流產(chǎn)率為10.7%(117/1 096)；宮外孕發(fā)生率為1.3%(14/1 096)；活產(chǎn)率為53.4%(965/1 808)。

二、不同冷凍保存時間的胚胎復(fù)蘇情況

囊胚冷凍時的各組患者平均年齡和內(nèi)膜厚度比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，復(fù)蘇移植時的患者年齡和不育年限比較有統(tǒng)計學(xué)差異，隨著胚胎冷凍保存時間的增加，復(fù)蘇時年齡增加(P<0.05)。盡管各組間移植胚胎數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但是第7組的移植胚胎數(shù)略低(表1)。

三、不同冷凍保存時間的胚胎復(fù)蘇后臨床結(jié)局

7組的胚胎存活率、胚胎種植率、早期妊娠丟失率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，但第5組的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率略低于其他組(表2)。

四、不同冷凍保存時間的胚胎復(fù)蘇后的出生結(jié)局

多胎妊娠的影響因素較多，為了避免降低分析的有效性，在本研究中我們只分析復(fù)蘇單囊胚移植的出生結(jié)局。我們發(fā)現(xiàn)7組間的孕天數(shù)、嬰兒出生體重及體長比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，低出生體重比例、男女性別比和畸形率亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)(表3)。

表1　各組患者一般情況比較 (x-±s)

注：組間比較，*P<0.05

表2　不同冷凍保存時間的胚胎復(fù)蘇后的臨床結(jié)局(%)

表3　單胎新生兒出生結(jié)局 (x-±s)

討論

胚胎冷凍技術(shù)是指將胚胎置于超低溫的環(huán)境(液氮，-196℃)中冷凍保存，待需要時再將冷凍的胚胎解凍恢復(fù)至正常生理溫度的技術(shù)。胚胎冷凍技術(shù)的出現(xiàn)，不僅可以使一次促排卵周期中形成的過剩胚胎得到保存，也避免了移植胚胎數(shù)量過多而引起的多胎，提高了治療的安全性，使患者從一次促排卵治療周期中獲得多次胚胎移植機(jī)會，大大提高了臨床累計妊娠率。因此，胚胎冷凍保存技術(shù)在輔助生殖操作中得到廣泛應(yīng)用。但是人們不禁擔(dān)心液氮中胚胎長期存放的安全性，以及隨著凍存時間的延長，解凍后胚胎的復(fù)蘇率和妊娠率等臨床結(jié)局會否受到影響。目前這些尚無定論。而且在之前的研究中，多是以慢速冷凍卵裂期胚胎為主，關(guān)于囊胚期胚胎玻璃化冷凍的研究較少。因此本研究著重分析囊胚玻璃化冷凍的保存時間對胚胎存活和臨床結(jié)局的影響。

關(guān)于胚胎在液氮中的保存時間尚無明確結(jié)論。早期有研究發(fā)現(xiàn)隨著冷凍保存時間的延長，人胚胎的復(fù)蘇后存活率下降[4]，小鼠胚胎復(fù)蘇后的活力下降且染色體異常的發(fā)生率增加[9]。但后期大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胚胎的冷凍保存時間不會影響凍融胚胎的質(zhì)量和存活。因為在超低溫中細(xì)胞的酶活力幾乎完全受抑，細(xì)胞進(jìn)程處于“停滯”狀態(tài)，Mazur[10]認(rèn)為細(xì)胞在液氮中保存千年依然可以存活并保持其發(fā)育潛能。Cohen等[11]發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間對卵裂球存活率沒有顯著影響，Lavara等[12]發(fā)現(xiàn)冷凍保存時間對兔胚胎的存活率沒有影響，最近Riggs等[13]對人胚胎進(jìn)行的一個大樣本的研究也表明冷凍時間的長短并不影響胚胎復(fù)蘇后的存活率。但是這些研究多是分析卵裂期胚胎冷凍的結(jié)局。最近Wirleitner等[14]分析了囊胚玻璃化冷凍后不同凍存時間的復(fù)蘇后存活情況，也發(fā)現(xiàn)囊胚的冷凍保存時間對囊胚復(fù)蘇后的存活率沒有顯著影響。我們的研究結(jié)論與之相似，在本研究中我們?nèi)坎捎貌ＡЩ鋬?，發(fā)現(xiàn)冷凍保存時間對胚胎復(fù)蘇后存活率沒有顯著影響。

為了進(jìn)一步觀察復(fù)蘇后胚胎的發(fā)育潛能，我們分析了相關(guān)臨床結(jié)局和冷凍時間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)囊胚的冷凍保存時間對胚胎的種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率沒有顯著影響。同時我們還觀察了新生兒出生結(jié)局，以分析囊胚長期冷凍保存的安全性。我們發(fā)現(xiàn)各組間新生兒的出生結(jié)局無統(tǒng)計學(xué)差異。因此，本研究認(rèn)為囊胚長期冷凍保存是安全的，這與之前的研究結(jié)論相似。Riggs等[13]分析了原核期胚胎和卵裂期胚胎冷凍保存數(shù)年復(fù)蘇后胚胎的活力與冷凍保存時間的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間不會影響復(fù)蘇后胚胎的活力，也不會影響臨床結(jié)局。Liu等[3]分析了卵裂期胚胎慢速冷凍復(fù)蘇后，胚胎的保存時間與臨床結(jié)局的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間不會影響卵裂期胚胎復(fù)蘇后的存活率，也不會影響胚胎的種植率和臨床妊娠率。目前胚胎的冷凍時機(jī)包括原核期、卵裂期和囊胚期，在前面的研究多是分析卵裂期胚胎長期冷凍保存后的結(jié)局，最近也有研究開始分析囊胚階段冷凍保存時間與臨床結(jié)局的關(guān)系。Yao等[15]分析了羊的桑葚胚或囊胚冷凍保存0.5年或7.5年后的臨床結(jié)局，他們發(fā)現(xiàn)兩組胚胎復(fù)蘇后活力無顯著性差異，追蹤出生結(jié)局發(fā)現(xiàn)兩組的出生率、性別比和出生體重均無明顯差異，他們認(rèn)為桑葚期或囊胚期胚胎可以在液氮中長期保存。Wirleitner等[14]發(fā)現(xiàn)人類囊胚玻璃化冷凍后的保存時間不會影響囊胚的活力和發(fā)育潛能，各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率以及出生后的新生兒特征均無顯著性差異。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)第3～5組(凍存時間181～1 080 d)的臨床妊娠率和活產(chǎn)率略低于保存時間短和保存時間更長組，分析原因可能與保存時間關(guān)系不大，可能是由于不同組別的患者特征造成的。如果患者在新鮮周期妊娠，意味著患者胚胎質(zhì)量好，更容易形成囊胚，種植潛能高，而且距離下次復(fù)蘇移植的時間會更久一些；而新鮮周期沒有妊娠或發(fā)生早期流產(chǎn)的，意味著患者胚胎質(zhì)量差，種植潛能差，多會在短期內(nèi)再進(jìn)行復(fù)蘇移植。具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

雖然理論上胚胎在液氮中可以長期保存，但是我們知道液氮罐的安全使用和宇宙背景的輻射也可能會影響胚胎的長期保存。如果液氮罐保存不恰當(dāng)，液氮補(bǔ)充不及時，都會影響胚胎的冷凍效果。為了保證胚胎冷凍時的降溫速率更高，我們多采用開放性載體進(jìn)行冷凍保存，而微生物也可以在低溫下長期存活，因此在保存過程中存在污染風(fēng)險[16]。關(guān)于宇宙輻射的影響，Glenister等[17]曾用相當(dāng)于自然界2 000年的宇宙背景累積輻射作用于小鼠胚胎，但小鼠胚胎的生存能力并未受到可檢測到的影響。

Dowling-Lacey等[18]曾報道原核期胚胎冷凍保存近20年后解凍移植，成功獲得妊娠并分娩健康男嬰。Reed等[19]也曾利用凍存13.5年的胚胎解凍移植，分娩一健康嬰兒。本研究中凍融胚胎移植獲得妊娠并分娩的病例中，最長冷凍保存時間為8.6年(3 085 d)?？傊?，本研究提示胚胎冷凍保存時間與凍融胚胎質(zhì)量和其發(fā)育潛力無明顯相關(guān)性，胚胎長期冷凍保存對新生兒結(jié)局無顯著影響。但是目前關(guān)于胚胎冷凍復(fù)蘇后妊娠獲得的新生兒的隨訪數(shù)據(jù)較少，因此囊胚長期冷凍保存的遠(yuǎn)期安全性還有待于進(jìn)一步研究。

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[編輯：羅宏志]

Effect of long-term cryopreservation of human blastocysts on clinical pregnancy outcome

WANG Xue，ZHEN Jing-ran，SUN Zheng-yi*，YU Qi，DENG Cheng-yan，ZHOU Yuan-zheng，WANG Han-bi，HE Fang-fang

Department of Obstetrics & Gynecology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100730

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.001

【收稿日期】2016-01-04；【修回日期】2016-02-18

【作者簡介】王雪，女，山東濰坊人，博士，實習(xí)研究員，生殖內(nèi)分泌專業(yè).(*通訊作者，Email：sunzhengyi@263.com)