豬瘟活疫苗中BVDV外源病毒一步法RT-PCR快速檢測方法的建立及應用

文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友文山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 沈志強

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豬瘟活疫苗中BVDV外源病毒一步法RT-PCR快速檢測方法的建立及應用

文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友文
山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 沈志強

摘 要為檢測商品化豬瘟細胞毒活疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染，根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5＇端非編碼區(qū)基因保守序列設計引物，建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒一步法反轉錄——聚合酶鏈(RT-PCR)方法，并對其特異性、敏感性進行了研究。該一步法RT-PCR對牛病毒性腹瀉病毒擴增結果為陽性，對照毒株擴增結果均為陰性，對牛病毒性腹瀉病毒檢測的靈敏性為1pg總RNA量，應用該方法，檢測了32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品，以上結果表明，該一步法RT-PCR方法檢測速度快、特異性強、敏感性高，可用于豬瘟細胞毒活疫苗中污染的BVDV外源病毒檢測。

關鍵詞豬瘟；牛病毒性腹瀉病毒；檢測

豬瘟(Classical swine fever，CSF)由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬高度傳染、致死性疾病，我國將豬瘟列為一類動物疫病[1]。牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、腹瀉、咳嗽、持續(xù)性感染與免疫耐受以及懷孕母牛流產(chǎn)、畸胎甚至死胎等為主要特征的牛傳染病[2]，我國將牛病毒性腹瀉病列為禁止入境的二類檢疫對象[3]。BVDV和CSFV同屬于黃病毒科瘟病毒屬中的成員[4]，BVDV還可引起豬、駱駝、羊、鹿等多種動物感染發(fā)病[5]，給各國養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。豬感染BVDV后可產(chǎn)生類似慢性豬瘟的臨床癥狀和病理變化，懷孕母豬可致流產(chǎn)，產(chǎn)出畸形胎兒[6]，免疫BVDV污染的豬瘟細胞毒活疫苗是豬感染BVDV一種重要途徑。BVDV主要通過生產(chǎn)過程中使用的牛血清、胰酶、牛睪丸等材料以及容器、設備污染豬瘟細胞活疫苗。對豬感染BVDV的現(xiàn)狀必須有清醒的認識和必要的防控措施。本研究根據(jù)GenBank公布BVDV基因序列，針對具有很高保守性的5′端非編碼區(qū)基因設計1對特異性引物，建立了一種特異、敏感的BVDV檢測方法，以確保疫苗的安全、有效，為商品化豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV污染提供一種有效的分子生物學檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型等均由本實驗室保存，32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品購買自不同廠家。

1.2 工具酶及試劑盒

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司、DNA Marker、PCR相關試劑、限制性內切酶、MD18-T載體、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3 RT-PCR引物設計與合成

參照GenBank中登錄的BVDV 5′端非編碼區(qū)序列，設計1對引物，上游引物：5- AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3′，下游引物：5′- TCTGCAGCACCCTATCAGG-3′，擴增BVDV 5′端非編碼區(qū)序列244bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取BVDV的RNA，并提取其他幾種病毒的RNA。

1.5 一步法 RT-PCR擴增及條件優(yōu)化

以RNA為模板進行一步法RTPCR擴增，反應體系為20μL。各參數(shù)為50℃逆轉錄30min，95℃預變性3min，然后進入95℃ 20s、56℃20s、72℃ 20s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸8min。取5μL產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。同時對各擴增條件進行優(yōu)化，包括退火溫度(50～60℃梯度溫度，每2℃為1個梯度)、引物濃度(0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L為1個梯度)等，反應體系均為20μL。

1.6 擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴增產(chǎn)物5μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體在16℃恒溫金屬浴中過夜連接，轉化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個的轉化菌落，加LB溶液培養(yǎng)18h后用質粒提取試劑盒抽提質粒，用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定，將測序結果與參照的BVDV序列同源性比較。

1.7 特異性試驗

分別提取牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的RNA，用已建立的方法進行擴增。

1.8 敏感性試驗

BVDV 病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取病毒基因組RNA，使其分別相當于含有10ng RNA、1ng RNA、100pg RNA、10pg RNA、1pg RNA、0.1 pg RNA的含量，分別進行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復性試驗

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，檢測3份牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.10 豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測

將購買的32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品稀釋為含有1頭份/200μL作為檢測樣品進行一步法RT-PCR擴增BVDV，同時設立陽性對照和陰性對照。并同時參照相關規(guī)程用細胞培養(yǎng)法檢驗并比較二者的一致性。

圖1 牛病毒性腹瀉病毒擴增結果

圖2 特異性試驗

2 結果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在244bp處可見特異性擴增帶，與預期大小相符(圖1)。挑取PCR鑒定陽性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果顯示，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與BVDV(登錄號：KJ620017)的序列相似性為100%。

2.2 特異性試驗

利用設計的引物和確定的最佳擴增條件分別對牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的核酸進行一步法RT-PCR。結果6個樣品中只有BVDV能擴增出大小為244bp目的片段，而其它均未擴增出相應的片段(圖2)，表明本試驗建立的方法有很好的特異性。

2.3 敏感性試驗

取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約244bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預期產(chǎn)物大小相符。從結果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達到1pg RNA(圖3)。

2.4 重復性試驗

經(jīng)過3次重復操作，結果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2.5 豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測

用建立的BVDV 一步法 RT-PCR檢測方法，共檢測了32批商品化豬瘟細胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染。細胞培養(yǎng)法的檢測結果與一步法 RT-PCR檢測方法的結果相同。

圖3 特異性試驗

3 討論

范學政等[7]用RT-PCR方法對23批次的豬瘟疫苗進行BVDV檢測，結果顯示，5批次豬瘟疫苗被BVDV污染，污染率達21.74%。范仲鑫等[8]用RTPCR方法對湖南省內銷售的10個廠家48個批次的豬瘟細胞苗進行BVDV病毒核酸檢測，結果表明，10個廠家的豬瘟細胞苗中有5個廠家檢出BVDV核酸陽性，48個批次中有9批次檢出BVDV核酸陽性，陽性率為18.75%。因此，必須對豬瘟活疫苗中的BVDV進行嚴格檢驗，禁止接種BVDV污染的豬瘟活疫苗，按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版三部)外源病毒檢驗方法[9]，對豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢驗主要采取細胞培養(yǎng)法，該法操作復雜，耗時間長，傳統(tǒng)的兩部法RT-PCR檢測方法時間長，操作繁瑣，需要先反轉錄成cDNA再進行PCR擴增，本試驗建立的BVDV一步法RT-PCR檢測方法操作簡單，不需要單獨做反轉錄，反轉錄與PCR擴增一步完成，能在3h內檢出BVDV，不僅節(jié)省了時間，而且減少了操作步驟，可方便快捷地擴增出目的片段，適合于大規(guī)模推廣應用[8]。

4 結論

本試驗建立的BVDV一步法RTPCR檢測方法，共檢測了32批商品化豬瘟細胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染，與細胞培養(yǎng)法檢測結果一致；所建立的方法為豬場基層獸醫(yī)工作者開展豬瘟細胞毒活疫苗樣品BVDV污染的檢測提供了一種簡單、有效的分子生物學檢測方法。

參考文獻：

[1] 國際獸疫局.哺乳動物,禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].3版.農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局(譯),1996:28～135.

[2] 殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997:538～548.

[3] 中華人民共和國動植物檢疫局.中國進出境動物檢疫規(guī)程手冊[M].北京:[出版者不詳],1997:132～134.

[4] 楊小燕,魏春華,劉建奎,等.豬源牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)科學,2011,41(1):9～13.

[5] 王新平,周緒斌.豬感染牛病毒性腹瀉病毒的研究進展[J].動物醫(yī)學進展,1998,19(1):1～3.

[6] 陶潔,廖金虎,張倩,等.豬感染牛病毒性腹瀉病毒研究進展[J]. 中國預防獸醫(yī)學報,2014(5):410～413.

[7] 范學政,寧宜寶,王琴,等.用RT-PCR方法檢測豬瘟細胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(1):8～10.

[8] 范仲鑫,張朝陽,劉道新,等.豬瘟細胞苗污染牛病毒性腹瀉病毒情況調查[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43(7):84～86.

[9] 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察室.非禽源活疫苗外源病毒檢驗技術[Z].北京:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,2013.

[10] Alansari H,Brock KV,Potgieter LN.Single and double polymerse chain reaction for detection of bovine diarrhea virus in tissue culture and sera [J]. J Vet Diagn Invest,1993,5(2):148～153.