實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測尿沉渣中miR-146a的表達及在類風濕關(guān)節(jié)炎中的臨床意義*

胡秋俠，李　博，吳系美，佘若男，譚錦輝，黃翠萍，唐群芳

（廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳　518109）

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實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測尿沉渣中miR-146a的表達及在類風濕關(guān)節(jié)炎中的臨床意義*

胡秋俠，李博，吳系美，佘若男，譚錦輝，黃翠萍，唐群芳

（廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518109）

摘要：目的探討實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time PCR）方法檢測類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者尿沉渣中miR-146a的表達情況，并分析其在RA中的臨床意義。方法收集80例RA患者（活動期46例，非活動期34例）及40例健康體檢者的清晨中段尿液，從尿沉渣中提取RNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測尿沉渣中miR-146a表達水平，并分析其與RA病情活動性及RA臨床表現(xiàn)之間的相關(guān)性。結(jié)果尿沉渣中miR-146a的表達水平，RA患者顯著高于健康體檢者［（0.70±0.04）比（0.17±0.01），P＜0.05］，活動期RA患者顯著高于非活動期RA患者［（0.91±0.05）比（0.42±0.04），P＜0.05］，非活動期RA患者顯著高于健康體檢者［（0.42±0.04）比（0.17±0.01），P＜0.05］，有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者顯著高于無關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者［（1.13±0.12）比（0.59±0.04），P＜0.05］。尿沉渣中miR-146a的表達水平與RA患者的DAS28評分呈正相關(guān)性（r=0.675，P＜0.05）、與血沉（ESR）呈正相關(guān)性（r=0.657，P＜0.05）、與C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平呈正相關(guān)性（r=0.522，P＜0.05），但與病程（r=0.052，P=0.650）、類風濕因子（RF，r=-0.049，P=0.664）及抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體，r=0.089，P=0.433）的滴度水平無明顯相關(guān)性（P >0.05）。結(jié)論miR-146a在RA患者尿沉渣中的表達顯著增高，并與RA病情活動度及特定臨床表現(xiàn)相關(guān)，提示miR-146a可能參與了RA的發(fā)病，可能有助于RA的診斷及病情活動性判斷。

關(guān)鍵詞：miR-146a；類風濕關(guān)節(jié)炎；外周血單個核細胞；類風濕因子

*廣東省醫(yī)學科研基金立項課題資助，項目編號：A2013611；廣東省深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（醫(yī)療衛(wèi)生類）資助，項目編號：201302182，項目編號201501051；廣東省深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新資金項目（醫(yī)療衛(wèi)生類）資助，項目編號：2013010，項目編號：20150924A1030103。

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵犯關(guān)節(jié)滑膜為特征的致殘性自身免疫性疾病，主要病理特征為滑膜細胞過度增殖以及大量血管翳形成，造成骨、軟骨侵蝕性破壞。RA的治療目前仍是一個世界難題，要解決這一難題，病因及發(fā)病機制方面的研究是關(guān)鍵。近年來的一些研究表明，RA患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中及滑膜成纖維細胞中miR-146a的表達存在異常，提示miR-146a可能參與了RA的發(fā)病。本研究中進一步檢測miR-146a在RA患者尿沉渣中的表達，旨在進一步研究miR-146a在RA發(fā)病中的作用。

1　資料與方法

1.1病例選擇

本研究中的80例RA患者均為本院2013年至2015年門診或住院患者，所有入選患者診斷均符合美國風濕病學會（ACR）1987年修訂的RA分類標準。80例RA患者中，男11例，女69例；年齡最小21歲，最大72歲，平均（44±17）歲；其中活動期RA患者46例作為A組，非活動期RA患者34例作為B組。另選擇本院門診健康體檢者40例作為正常對照組（C組），其中男6例，女34例；年齡最小21歲，最大74歲，平均（45±18）歲。RA患者的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)是指關(guān)節(jié)炎以外的其他所有臨床表現(xiàn)，包括眼部病變、肺部病變、皮膚病變、類風濕結(jié)節(jié)、血液系統(tǒng)病變等。

1.2試驗方法

采集以上研究對象的外周血液標本5 mL，取2 mL抗凝用于血沉（ESR）的測定；另3 mL抗凝用于分離采集血清，以進行臨床免疫學及生化項目檢測。

收集每例研究對象的清晨中段尿液50 mL，立即在室溫、3 000 g/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，棄上清液，將尿沉渣用1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)，置4℃離心機中，在130 000 g/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清，將沉渣放入-80℃冰箱保存，用于提取RNA。

采用Trizol法按說明書提取總RNA，用核酸紫外分析儀檢測RNA濃度，保證OD260/280位于1.8～2.0，將RNA凍存于-80℃冰箱中，備用。

采用TaqMan⑧microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI公司），反應(yīng)體系為15 μL，按說明書操作。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：16℃30 min，42℃30min，85℃5 min，然后4℃延伸。選用RUN6為內(nèi)參照。

采用ABI公司的TaqMan⑧PCR試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，按說明說操作。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃變性10 min，然后95℃15 s、60℃60 s進行40個循環(huán)。引物序列正向為：ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATGGGT；反向為：CTCAACTGGTGTCGTGGA。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，比較不同組間計量資料差異時行獨立t檢驗，比較不同組間性別差異時采用方差分析，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有顯著性。

2　結(jié)果

2.1入選對象一般臨床資料

RA患者與正常對照組、活動期RA患者與非活動期RA患者及非活動期RA患者與正常對照組間的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P >0.05），詳見表1。

表1　一般臨床資料比較

2.2miR-146a的表達

RA患者尿沉渣中miR-146a的表達水平顯著高于健康體檢者（P＜0.05）?；顒悠赗A患者及尿沉渣中miR-146a的表達水平顯著高于非活動期RA患者（P＜0.05），非活動期RA患者尿沉渣中miR-146a的表達水平與健康體檢者比較無顯著性差異（P >0.05），有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者尿沉渣中miR-146a的表達水平顯著高于無關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者（P＜0.05）。詳見表2。

表2　入選研究對象miR-146a表達水平的比較（±s）

表2　入選研究對象miR-146a表達水平的比較（±s）

注：*為A + B組與C組相比；#為A組與B組相比；＄為B組與C組相比；**為有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者與無關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者相比。

研究對象RA患者（A +B組）活動期RA患者（A組）非活動期RA患者（B組）健康體檢者（C組）有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者無關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者miR-146a表達水平0.71±0.04 0.91±0.05 0.42±0.04 0.17±0.01 1.13±0.12 0.59±0.04 t值8.417-6.901 7.052-5.984 P值0.000*0.005#0.000＄0.000**

2.3miR-146a與RA患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，尿沉渣中miR-146a的表達水平與RA患者的DAS28評分呈正相關(guān)性（r=0.675，P＜0.05）、與血沉（ESR）呈正相關(guān)性（r=0.657，P＜0.05）、與C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平呈正相關(guān)性（r=0.522，P＜0.05），但與病程（r=0.052，P=0.650）、類風濕因子（RF）（r=-0.049，P=0.664）及抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體，r=0.089，P=0.433）的滴度水平無明顯相關(guān)性（P >0.05）。

3　討論

microRNA也被稱為微小RNA或miRNA，通過與靶mRNA的結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與了機體細胞的分化、增殖、發(fā)育、凋亡及先天性與獲得性免疫應(yīng)答等多種生物學過程，與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如癌癥、糖尿病、心臟病、感染及某些風濕性疾病等，并有可能成為這些疾病的診斷、病情活動性及療效判斷的標記物，甚至成為潛在的治療靶點［1］。miR-146a由于靶目標相對明確［2-3］，從而在RA發(fā)病的研究中備受關(guān)注。目前，多項研究已經(jīng)表明，miR-146a在RA患者中的表達和正常人及骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者相比存在異常，表達異常的部位既包括滑膜及滑膜的成纖維細胞［4-9］，也包括外周血單個核細胞（PBMCs），特別是CD4+T細胞［10-14］。除了表達異常，還發(fā)現(xiàn)miR146a在RA中的表達與RA的病情活動性相關(guān)［6］。有學者推斷其原因可能是，這些患者體內(nèi)過多表達的的白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥相關(guān)細胞因子以NF-KB依賴的方式誘導(dǎo)miR-146a基因轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)［15］。

microRNAs異常表達不僅存在于腫瘤組織、PBMC中，還廣泛存在于正常人和不同病種患者的血清、血漿及尿液中，并具有良好的抗RNase降解能力，有較高的穩(wěn)定性。以上提示尿液中microRNAs可以成為潛在的疾病無創(chuàng)診斷和預(yù)后的生物標志物。尿液中miRNA不僅可作為腫瘤的分子標志物，還可用于判斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他疾病及妊娠［16-17］。但到目前為止，關(guān)于RA患者尿液中microRNAs表達情況及其意義的研究尚未見報道。

為了進一步探討miR-146a在中國RA患者中的意義，本研究中對80例RA患者（活動期46例，非活動期34例）及40例健康體檢者尿沉渣中miR-146a的表達水平進行檢測，并分析了其與RA病情活動性及臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，RA患者尿沉渣中miR-146a的表達水平顯著高于健康體檢者，活動期RA患者顯著高于非活動期RA患者，非活動期RA患者與健康體檢者相比無顯著性差異，有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者顯著高于無關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者。

總之，本研究中初步探討了miR-146a在RA中的意義，結(jié)果顯示miR-146a在RA患者尿沉渣中的表達顯著增高，并與RA病情活動度及特定臨床表現(xiàn)相關(guān)，提示miR-146a可能參與了RA的發(fā)病，可能有助于RA的診斷及病情活動性判斷。至于miR-146a參與RA發(fā)病的具體機制，尚需進一步進行功能方面的研究。

參考文獻：

［1］Eisa Salehi，Rahil Eftekhari，Mona Oraei，et al.MicroRNAs in rheumatoid arthritis［J］.Clin Rheumatol，2015，34：615-628.

［2］Ahmad R，Sylvester J，Zafarullah M.MyD88，IRAK1 and TRAF6 knockdown in human chondrocytes inhibits interleukin-1-induced matrix metalloproteinase-13 gene expression and promoter activity by impairing MAP kinase activation［J］.Cell Signal，2007，19：2 549-2 557.

［3］Chatzikyriakidou A，Voulgari PV，Georgiou I，et al.A polymorphism in the 3′-UTR of interleukin-1 receptor-associated kinase（IRAK1），a target gene of miR-146a，is associated with rheumatoid arthritis susceptibility［J］.Joint Bone Spine，2010，77：411-413.

［4］Nakamachi Y，Kawano S，Takenokuchi M，et al.MicroRNA-124a is a key regulator of proliferation and monocyte chemoattractant protein 1 secretion in fibroblast-like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2009，60（5）：1 294-1 304.

［5］Murata K，Yoshitomi H，Tanida S，et al.Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther，2010，12（3）：R86.

［6］Li J，Wan Y，Guo Q，et al.Altered microRNA expression profile with miR-146a upregulation in CD4+T cells from patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2010，12：R81.

［7］Nakasa T，Miyaki S，Okubo A，et al.Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue［J］.Arthritis Rheum，2008，58（5）：1 284-1 292.

［8］Abou-Zeid A，Saad M，Soliman E.MicroRNA 146a expression in rheumatoid arthritis：association with tumor necrosis factoralpha and disease activity［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2011，15（11）：807-812.

［9］Stanczyk J，Pedrioli DM，Brentano F，et al.Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2008，58（4）：1 001-1 009.

［10］Niimoto T，Nakasa T，Ishikawa M，et al.MicroRNA-146a expresses in interleukin-17 producing T cells in rheumatoid arthritis patients［J］.BMC Musculoskelet Disord，2010，11：209.

［11］Pauley KM，Satoh M，Chan AL，et al.Upregulated miR-146a expression in eripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients［J］.Arthritis Res Ther，2008，10（4）：R101.

［12］Zhou Q，Haupt S，Kreuzer JT，et al.Decreased expression of miR-146a and miR-155 contributes to an abnormal Treg phenotype in patients with rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2015，74（6）：1 265-1 274.

［13］Nakasa T，Shibuya H，Nagata Y，et al.The inhibitory effect of microRNA-146a expression on bone destruction in collagen-induced arthritis［J］.Arthritis Rheum，2011，63（6）：1 582-1 590.

［14］Smigielska-Czepiel K，van den Berg A，Jellema P，et al.Comprehensive analysis of miRNA expression in T-cell subsets of rheumatoid arthritis patients reveals defined signatures of naive and memory Tregs［J］.Genes Immun，2014，15（2）：115-125.

［15］Churov AV，Oleinik EK，Knip M.MicroRNAs in rheumatoid arthritis：altered expression and diagnostic potential［J］.Autoimmun Rev，2015，14（11）：1 029-1 037.

［16］Wang Q，Wang S，Wang H，et al.MicroRNAs：novel biomarkers for lung cancer diagnosis，prediction and treatment［J］.Exp Biol Med（Maywood），2012，237（3）：227-235.

［17］Nair VS，Maeda LS，Ioannidis JP.Clinical Outcome Prediction by MicroRNAs in Human Cancer：A Systematic Review［J］.J Natl Cancer Inst，2012，104（7）：528-540.

Expression of miR-146a Detected by Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay in the Urinary Sediment of Patients with Rheumatoid Arthritis and Its Clinical Significance

Hu Qiuxia，Li Bo，Wu Ximei，She Ruonan，Tan Jinhui，Huang Cuiping，Tang Qunfang
（Department of Rheumatology，People′s Hospital of New District Longhua Shenzhen，Shenzhen，Guangdong，China 518109）

Abstract：Objective To explore the expression of miR-146a detected by real-time PCR in the urinary sediment of patients with rheumatoid arthritis（RA），with an attempt to explore its clinical significance in RA.Methods The morning midstream urine of 80 cases of RA patients（46 cases active，34 cases inactive）and 40 cases of healthy controls were collected and the RNA was extracted from the urine sediment.The expression level of miR-146a was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（real time PCR）and the correlation with disease activity in RA and RA clinical manifestations were analyzed.Results The expression level of miR-146a in RA patients was（0.70±0.04），which was significantly higher than（0.17±0.01）in the healthy controls（P＜0.05）.The expression levels of miR-146a in active RA patients was（0.91±0.05），which was higher than（0.42±0.04）in inactive RA patients（P＜0.05）.The expression levels of miR-146a in inactive RA patients was higher than in the healthy controls［（1.17±0.01）vs （0.63±0.04），P＜0.05］.The expression levels of miR-146a in RA patients with extraarticular manifestations was（1.13±0.12），which was higher than in RA patients without extraarticular manifestations（0.59±0.04）（P＜0.05）.The expression level of urinary miR-146a was positively correlated with disease activity score in 28 joints（DAS28）（r=0.675，P＜0.05），ESR（r=0.657，P＜0.05）and CRP（r=0.522，P＜0.05），but not correlated with disease duattion（r=0.052，P=-0.650），RF（r=0.049，P=0.664）and anti-CCP antibodies （r=0.089，P=-0.443）.Conclusion The expression level of urinary miR-146a was significantly higher in RA patients and correlated with some clinical features of RA，indicating that miR-146a may play a role in the pathogenesis of RA.

Key words：miR-146a；rheumatoid arthritis；urinary；rheumatoid factor

中圖分類號：R363.2；R593.22

文獻標識碼：A

文章編號：1006-4931（2016）07-0077-04

作者簡介：胡秋俠，安徽阜陽人，大學本科，主管護師，研究方向為常見風濕病和腎臟病的護理，（電子信箱）genefan@163.com；李博，安徽宿州人，在讀在職博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向為常見風濕性疾病的發(fā)病機制研究，本文通訊作者，（電子信箱）friendlybo@163.com。

收稿日期：（2015-12-01）