感冒熱毒清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄒曉華，戴安印，何偉康，鄒　杰，杜景伶，張　揚

（1.中國人民解放軍第117醫(yī)院，浙江杭州　310013；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江杭州　310007）

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感冒熱毒清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄒曉華1，戴安印1，何偉康1，鄒杰1，杜景伶1，張揚2

（1.中國人民解放軍第117醫(yī)院，浙江杭州310013；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江杭州310007）

摘要：目的建立感冒熱毒清合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜（TLC）法對感冒熱毒清合劑中的主要藥味連翹、金銀花、板藍根、熟地黃進行定性鑒別。采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中連翹苷及綠原酸的含量，連翹苷測定時色譜柱為C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（76∶24），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為277 nm；綠原酸測定時色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸（88∶12），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為327 nm。結(jié)果連翹、金銀花、板藍根與熟地黃的TLC圖斑點清晰、分離較好，陰性對照無干擾。連翹苷質(zhì)量濃度在6.88～137.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 2），綠原酸質(zhì)量濃度在5.02～100.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 5）。連翹苷的平均回收率為99.30%，綠原酸的平均回收率為101.93%（n=9）。結(jié)論該方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評價方法。

關(guān)鍵詞：感冒熱毒清合劑；連翹苷；綠原酸；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

感冒熱毒清合劑（南制字2011F19001）是醫(yī)院根據(jù)中醫(yī)驗方結(jié)合臨床實踐研制而成的適合臨床、質(zhì)量穩(wěn)定、作用快、療效好的純中藥制劑。其由連翹、金銀花、石膏、蒲公英、板藍根、地黃、知母等8味中藥組方，具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，用于治療流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃腺炎、咽喉炎等各種發(fā)熱性疾病。為有效控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效［1-3］，筆者采用薄層色譜法［4］對連翹、金銀花、板藍根、地黃進行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法［4］制訂了該制劑中連翹苷及綠原酸的含量測定方法。該方劑中連翹、金銀花與石膏為君藥，連翹苷為連翹中的主要成分，綠原酸為金銀花中的主要成分，板藍根與蒲公英為臣藥，選取綠原酸和連翹苷為指標(biāo)成分進行含量測定，穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為感冒熱毒清合劑的質(zhì)量控制方法?，F(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AE240型電子天平（瑞士METTLER公司）；HH-S數(shù)控恒溫水浴鍋（金華市文華科教實驗儀器廠）；KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；三用紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司）；硅膠GF254薄層板（青島海藥化工廠，批號為20120708）。

1.2試藥

連翹苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110821-201213，純度為95.3%）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753-201314，純度為96.6%）；對照藥材連翹（批號為20121201），金銀花（批號為20110806），板藍根（批號為20130601），地黃（批號為20130706），均由杭州凱倫中藥飲片公司提供；感冒熱毒清合劑樣品（解放軍第117醫(yī)院制劑室，批號為20140218，20131220，20140401，20140117，20141024）；正丁醇（分析純，天津市永化化學(xué)試劑有限公司，批號為20120507）；氨水（分析純，浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司，批號為20130901）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國MERCK公司，批號為20140114）；水為超純水（解放軍第117醫(yī)院制劑室）；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1連翹

取感冒熱毒清合劑樣品20 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液，加氨試液20 mL和水20 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層水浴蒸干，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取缺連翹陰性樣品同法制成陰性對照品溶液。再取連翹苷對照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗，吸取上述3種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（8.5∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘至斑點清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點。見圖1。

圖1　連翹薄層色譜圖

2.1.2金銀花

取感冒熱毒清合劑樣品5 mL，滴加稀鹽酸使pH為 1～2，用醋酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取缺金銀花陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法［2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗，吸取上述3種溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（2∶30∶2∶2∶4，V/V/V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點。見圖2。

圖2　金銀花薄層色譜圖

2.1.3板藍根

取感冒熱毒清合劑樣品50 mL，用二氯甲烷提取3次（40，30，30 mL），合并提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取板藍根對照藥材2.5 g，加二氯甲烷30 mL，超聲20 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。根據(jù)感冒熱毒清合劑處方，按照樣品制備方法制備缺板藍根樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗，取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-二氯甲烷-丙酮（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。見圖3A。

2.1.4地黃

取感冒熱毒清合劑樣品100 mL，用醋酸乙酯提取3次（40，30，30 mL），合并提取液用水洗滌3次（30，20，20 mL），醋酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取地黃對照藥材2 g，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液用醋酸乙酯提取3次（40，30，30 mL），合并提取液用水洗滌3次（30，20，20 mL），醋酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。根據(jù)感冒熱毒清合劑處方，按照樣品制備方法制備缺熟地黃樣品，按照供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗，取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視后。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。見圖3B。

圖3　板藍根、地黃薄層色譜圖

2.2連翹苷、綠原酸含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

連翹苷：色譜柱為資生堂Shiseido Capcell Pakmg-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（76∶24，V/V）；檢測波長277 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30℃。理論板數(shù)按連翹苷峰計算，應(yīng)不低于3 000。該色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀測定，結(jié)果陰性對照品溶液在連翹苷峰相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見圖4。

綠原酸：色譜柱為資生堂Shiseido Capcell Pakmg-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.4%磷酸（88∶12，V/V）；檢測波長327 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫40℃。理論板數(shù)按綠原酸峰計算，應(yīng)不低于1 000。該色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀測定，結(jié)果陰性對照品溶液在綠原酸峰相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見圖5。

圖4　連翹苷含量測定高效液相色譜圖

圖5　綠原酸含量測定高效液相色譜圖

2.2.2溶液制備

對照品溶液：稱取連翹苷對照品3.44 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為連翹苷對照品溶液。稱取綠原酸對照品10.04 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即為綠原酸對照品溶液。

連翹苷供試品及陰性對照品溶液：取感冒熱毒清合劑樣品50 mL，加水飽和的正丁醇50 mL萃取2次，合并2次的正丁醇層溶液，加氨試液50 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層置80℃水浴蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻度，作為連翹苷含量測定的供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含連翹的陰性對照溶液適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

綠原酸測定供試品及陰性對照品溶液：取感冒熱毒清合劑樣品25 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲提取30 min，冷卻后，用甲醇補足體積，作為綠原酸含量測定的供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含金銀花的陰性對照溶液適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取連翹苷或綠原酸對照品溶液，進行梯度稀釋，注入液相色譜儀各10 μL，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程，連翹苷為Y=14 787 X-60 772 （r=0.999 2），綠原酸為Y=23 009 X + 51 645（r=0.999 5）。結(jié)果表明，連翹苷與綠原酸對照品質(zhì)量濃度分別在6.88～137.6 μg/mL和5.02～100.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取同一連翹苷或綠原酸對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為1.80%（n=5），綠原酸峰面積的RSD 為0.99%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20140218）適量，依法制備供試品溶液，于常溫條件放置0，4，8，12，24 h后，分別進樣20 μL，記錄連翹苷峰面積，結(jié)果的RSD 為1.31%（n=5）。取樣品（批號為20131220）適量，依法操作，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為1.45%（n=5）。供試品溶液至少在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為20131220），平行制備6份供試品溶液，依法測定含量。結(jié)果連翹苷含量的RSD為1.24%（n=6），綠原酸含量的RSD為1.30%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的感冒熱毒清合劑適量，共9份，每份10 mL，分別精密加入高、中、低量級的連翹苷對照品，依法操作，測定含量。結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.2.4樣品含量測定

取5批樣品（批號為20140218，20131220，20140401，20140117，20131024），依法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC儀中進行含量測定，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果（μg/mL，n=2）

3　討論

感冒熱毒清合劑由連翹、金銀花、板藍根、地黃等組方，其中連翹與金銀花為本合劑中的主要成分。連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效，用于癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病初期、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋澀痛；有效成分連翹苷具有極強的抗菌、抗病毒活性，對金黃色葡萄球菌的抑制作用比四環(huán)素還強，還可直接破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)，以消除或減輕細(xì)菌毒素引起的休克等各種中毒癥狀［5-7］，是迄今連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強的成分之一，是中藥連翹的主要特征性成分。金銀花有“中藥中的抗生素”之譽，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱［8］；含有大量有機酸，研究發(fā)現(xiàn)，金銀花提取物及其所含的化學(xué)成分具有多種藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤等，其中綠原酸為主要成分之一。因此，針對該制劑探討連翹及金銀花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立一種有效的檢測方法，對于控制制劑質(zhì)量很有必要。

本研究中對感冒熱毒清合劑中的主要成分連翹、金銀花、板藍根、地黃進行定性鑒別，針對組方中連翹及金銀花指標(biāo)成分，建立了連翹苷和綠原酸的含量測定方法［9］，本法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評價方法。

采用正丁醇萃取、氨水洗滌并濃縮的方法，可去除合劑中其他成分對連翹苷在HPLC色譜圖上的干擾。在供綠原酸含量測定用的供試品溶液制備過程中，因綠原酸的不穩(wěn)定性和見光分解的特性，故采用甲醇為提取溶劑，并在提取、灌裝及保存過程中應(yīng)注意避光，保存于棕色瓶中，提取效率高。

不同批號的樣品由于原材料產(chǎn)地、采集時節(jié)不同，存放時間及條件不同，對合劑中的連翹苷和綠原酸含量有較大的影響［10］。因此該合劑的質(zhì)量控制應(yīng)嚴(yán)格從源頭抓起，即嚴(yán)格把握原藥材的質(zhì)量。

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Quality Standard of Ganmaoreduqing Mistura

Zou Xiaohua1，Dai Anyin1，He Weikang1，Zou Jie1，Du Jingling1，Zhang Yang2
（1.Department of Pharmncy，117th Hospital of PLA，Hangzhou，Zhejiang，China 310013；2.Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou，Zhejiang，China 310007）

Abstract：Objective To establish the quality standard of Ganmaoreduqing Mistura.Methods The chief components of the preparation，F(xiàn)orsythiae fructus，Lonicerae japonicae flos，Isatidis radix，Rehmanniae radix were identified by TLC qualitatively.The content of phillyrin and chlorogenic acid in mistura was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），acetonitrile-water（76∶24）was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min.The columm temperature was set at 30℃and the wavelength of the detector was set at 277 nm.The content of chlorogenic acid in mistura was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），acetonitrile-0.4%phosphoric acid（88∶12）was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min.The columm temperature was set at 40℃and the wavelength of the detector was set at 327 nm.Results The spots in the TLC figure of the Arabesques of forsythia，flos lonicerae，radix isatidis and rehmannia glutinosa were clear，better separated，and no negative control interference.The linear range for phillyrin was 6.88-137.6 μg/mL（r=0.999 2），and the linear range for chlorogenic acid was 5.02-100.4 μg/mL（r=0.999 5）.The average recovery for phillyrin were 99.30%，and the average recovery for chlorogenic acid were 101.93%（n=9）.Conclusion The method is accurate，reproducible and suitable，which can be used for quality assessment of Ganmaoreduqing Mistura.

Key words：Ganmaoreduqing Mistura；phillyrin；chlorogenic acid；TLC；HPLC；quality standard

中圖分類號：R284.1；R286.0

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-4931（2016）07-0048-05

收稿日期：（2015-07-28）