卵清蛋白水解及抗氧化肽制備工藝研究

薛海燕， 王戰(zhàn)勇， 宋宏新， 李　珊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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卵清蛋白水解及抗氧化肽制備工藝研究

薛海燕， 王戰(zhàn)勇， 宋宏新， 李珊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：卵清白蛋白是蛋清中主要的過(guò)敏原之一，采用胃蛋白酶水解可降低其過(guò)敏原性.本研究通過(guò)制備卵清白蛋白抗氧化活性多肽，以DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，考察了底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量等因素對(duì)卵清白蛋白多肽抗氧化活性的影響.正交試驗(yàn)結(jié)果表明，胃蛋白酶的最佳水解條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間5 h、加酶量9 000 U/g，在此條件下卵清蛋白的水解度和DPPH自由基清除率均達(dá)到最大，分別為83.9%和89.2%.該條件下獲得的卵清蛋白水解液可作為抗氧化劑或富含多種氨基酸的白蛋白營(yíng)養(yǎng)液，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.

關(guān)鍵詞：卵清白蛋白； 胃蛋白酶； 抗氧化活性； 水解度

0引言

卵白蛋白(Egg Albumin)是一種磷酸糖蛋白質(zhì)，其含量占蛋清總蛋白質(zhì)的54%，是蛋清中最主要的蛋白質(zhì)[1]，由386個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為45 000，等電點(diǎn)為4.5[2].卵白蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高、加工與生物學(xué)性能良好，具有典型的蛋白質(zhì)膠凝、乳化和起泡等功能特性，可在食品加工中賦予食品特殊的口感和風(fēng)味.此外，還在免疫學(xué)研究和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及抗體制備中具有重要作用[3,4].

卵白蛋白經(jīng)酶水解后形成多種活性肽，如增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等多種生理活性，其中抗氧化活性肽是研究最多的活性肽之一[5,6].已有報(bào)道證實(shí)抗氧化肽還具有抗癌、抗誘導(dǎo)、抗血栓、抗衰老和疲勞等多種生物活性[7,8]，并能有效清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基，保護(hù)線粒體和細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能，抑制油脂氧化和螯合金屬離子[9,10].Davalos等[11]研究發(fā)現(xiàn)卵白蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，可得到四種抗氧化肽，并且這4種抗氧化肽序列均包含于卵白蛋白序列中.

卵白蛋白分子由386個(gè)氨基酸殘基組成，其中50%以上為疏水氨基酸.胃蛋白酶能作用于芳香族氨基酸(Leu、Asp、Glu)或其它疏水性氨基酸的羧基和氨基形成的肽鍵，而Leu和Glu殘基與多肽的抗氧化相關(guān)[12].因此，本研究采用胃蛋白酶酶解卵清蛋白，探討了其酶解獲得抗氧化活性肽的最佳工藝條件，可為酶解卵白蛋白產(chǎn)生活性肽的生產(chǎn)工藝提供技術(shù)依據(jù).

1材料與方法

1.1材料與儀器

(1)主要材料：卵清蛋白A5253(純度62%～88%)， Sigma公司；胃蛋白酶(酶活≥3 000 U/g)， Sigma公司；二苯基苦基苯肼(DPPH，分析純)，Sigma公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司.

(2)主要儀器：752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；HC-3081型高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì),北京賽多利斯儀器有限公司；HH-1型恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司；GL-802B型臺(tái)式真空泵,江蘇其林貝爾儀器制造有限公司.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1卵清蛋白的提取

(1)雞蛋蛋清液的制備

在流水下去除蛋殼表面異物，打蛋分離蛋清與蛋白，攪拌至蛋清無(wú)泡沫.分別取10 mL的蛋清液6份，分別不加水、加1倍、加2倍、加3倍、加4倍、加5倍體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋.

(2)鹽析

在室溫下，分別向6份蛋清液中加入等體積的飽和硫酸銨溶液(即50%飽和硫酸銨)進(jìn)行鹽析，靜置1 h后在5 000 r/min下離心20 min，去除沉淀，將上清液pH調(diào)至4.6，去除其中卵白蛋白和卵粘蛋白，放置于冰箱中4 ℃過(guò)夜，將上清液在5 000 r/min下離心20 min，去除上清，留沉淀.

(3)超濾

將沉淀用水溶解，采用兩步法超濾.第一步：采用50 kDa膜超濾，透過(guò)液作為第二步原料；第二步：用30 kDa膜超濾，保留濃縮液，冷凍干燥后得卵白蛋白產(chǎn)物，操作壓力控制在20～40 psi.用0.1 mol/L的氯化鋇溶液檢驗(yàn)是否完全去除硫酸銨.

1.2.2胃蛋白酶的水解方法

用pH7.4的pbs緩沖液100 mL溶解3 g卵清蛋白→用鹽酸調(diào)pH至1.8→將樣品置于37 ℃水浴鍋里→待樣品溫度升至酶解溫度時(shí)加酶→酶解一定時(shí)間→用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至5.0滅酶→離心(3 000 r/min，20 min)→取上清液待測(cè).

1.2.3胃蛋白酶水解因素的考察

在反應(yīng)溫度37 ℃、pH 2.0時(shí)，改變底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間4 h、加酶量8 000 U/g等三者中的一個(gè)，保持其余兩個(gè)值不變，將時(shí)間調(diào)整為3 h、4 h、5 h、6 h、底物濃度調(diào)整為2%、3%、4%、5%、加酶量調(diào)整為7 000 U/g、8 000 U/g、9 000 U/g、10 000 U/g，來(lái)測(cè)定這三個(gè)條件對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響.

1.2.4檢測(cè)方法

(1)DPPH自由基清除率的測(cè)定

抗氧化活性可通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除率[13]來(lái)實(shí)現(xiàn).即用100 mL無(wú)水乙醇溶解10 mg DPPH得到儲(chǔ)備液，避光保存.使用時(shí)，稀釋4倍得6.5×10-5mol/L的DPPH溶液，另將待測(cè)抗氧化劑配制成系列溶液.

對(duì)照組：2.5 mL的6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液+0.5 mL蒸餾水；樣品：2.5 mL的6.5×10-5DPPH mol/L乙醇溶液+0.5 mL樣液；空白組：2.5 mL無(wú)水乙醇溶液+0.5 mL樣液.

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(1)

式(1)中:A0—對(duì)照組吸光值；Ai—樣液吸光值；Aj—未加DPPH的空白組吸光值.

(2)蛋白水解度的測(cè)定

蛋白水解度按式(2)進(jìn)行計(jì)算：

蛋白水解度(%)=(氨基態(tài)氮/總氮)×100%

(2)

式(2)中：氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法[14]測(cè)定，總氮采用微量凱氏定氮法[15]測(cè)定.

(3)SDS-PAGE電泳鑒定

根據(jù)式(1)～式(11)可定量計(jì)算水泥-礦渣二元體系的水化產(chǎn)物，為便于計(jì)算，這里假定活性氧化鋁的與石膏反應(yīng)形成的鋁酸鹽相均轉(zhuǎn)化為單硫型硫鋁酸該所以式(3)、式(5)和式(11)的反應(yīng)不會(huì)發(fā)生。根據(jù)上述反應(yīng)的近似化學(xué)計(jì)量式和表3給出的各物質(zhì)的摩爾質(zhì)量和摩爾體積，可定量計(jì)算水化產(chǎn)物的質(zhì)量以及體積，其中質(zhì)量表達(dá)式為

將提取的卵清蛋白采用12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE電泳鑒定純度.

1.2.5胃蛋白酶水解制備抗氧化活性肽的正交試驗(yàn)優(yōu)化

以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量為考察因素，以DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，選取兩個(gè)水平，進(jìn)行L4(23)正交試驗(yàn)，以確定胃蛋白酶水解卵白蛋白的最佳工藝條件，并對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2結(jié)果與分析

2.1卵白蛋白的提取結(jié)果

硫酸銨是蛋白質(zhì)鹽析時(shí)常用的中性鹽，其濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度具有顯著影響.pH是影響鹽析的主要因素，當(dāng)鹽溶液pH為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最低，最易沉淀析出.雞蛋清中的主要蛋白質(zhì)除卵白蛋白外，還有卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類(lèi)黏蛋白、卵粘蛋白、溶酶菌等.

實(shí)驗(yàn)中，將鹽析離心后的上清液pH調(diào)至4.6，使卵白蛋白和卵粘蛋白達(dá)到等電點(diǎn)沉淀下來(lái)，兩者的等電點(diǎn)分別在4.5～4.8和4.5～5.1.鹽析后采用兩步超濾來(lái)去除雜蛋白和硫酸銨，第一步選用50 kDa超濾膜可除去抗生物素蛋白、卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑、G3卵球蛋白等分子量在50 kDa以上的蛋白質(zhì)，而卵白蛋白(45 kDa)、溶菌酶(14.3 kDa)進(jìn)入透過(guò)液中，成為第二步超濾的原料；第二步選用30 kDa超濾膜可去除溶菌酶和硫酸銨，從而保留了卵白蛋白.

采用半飽和硫酸銨兩步鹽析法提取出的卵白蛋白，在進(jìn)行透析去除硫酸根離子后，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，其結(jié)果如圖1所示.M為標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白，相對(duì)分子量為14 400～97 000.6個(gè)樣品的條帶均集中在45 kDa附近，而卵白蛋白分子量為45 kDa，所以提取出的蛋白質(zhì)就是卵白蛋白；66 kDa到97 kDa之間的條帶可能是一些分子量較大的蛋白沒(méi)有被完全除去的緣故；第四泳道45 kDa主條帶很清晰，45 kDa到66 kDa的明顯被去除，卵類(lèi)黏蛋白和卵粘蛋白的分子量分別為23 kDa和2.8 kDa都被明顯除去.綜合比較，稀釋3倍時(shí)的分離效果較好.

標(biāo)有數(shù)字1、2、3、4、5、6的6列依次是不加蒸餾水、加1倍、加2倍、加3倍、加4倍、加5倍體積蒸餾水的蛋清液經(jīng)鹽析、透析后的樣品蛋白液.圖1　卵清蛋白的純化SDS-PAGE電泳圖

2.2不同水解條件對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.2.1胃蛋白酶酶解底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

胃蛋白酶水解度隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～5%時(shí)，水解度增長(zhǎng)趨于平緩，如圖2所示.這表明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)4%時(shí)，酶的催化能力已經(jīng)飽和，再增加底物濃度，其反應(yīng)速率也不會(huì)再有所增加.故選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖2　底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.2.2胃蛋白酶酶解時(shí)間的影響

如圖3所示，在酶解時(shí)間為4 h，時(shí)DPPH自由基清除能力達(dá)到85.0%.在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，胃蛋白酶與底物充分結(jié)合使DPPH自由基清除能力和水解度均快速增大；在4 h后，水解度依然增加，但DPPH自由基清除能力卻在下降，表明抗氧化肽活性與片段長(zhǎng)度相關(guān)，水解度增加，水解促使多肽變短，導(dǎo)致了DPPH自由基清除能力下降.綜合考慮其它因素，可選擇4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖3　酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.2.3胃蛋白酶酶解加酶量的影響

如圖4所示，當(dāng)?shù)孜镆欢〞r(shí)，初始隨加酶量的增加，水解度增加較快，在加酶量為8 000 U/g時(shí)，DPPH自由基清除能力達(dá)到86.3%.隨著水解度提升多肽的含量增加，但具有抗氧化活性的多肽卻減少，說(shuō)明抗氧化活性肽具有特定結(jié)構(gòu)和分子量；此外，已有研究報(bào)道[16]，當(dāng)酶量過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶本身的水解作用增強(qiáng)，也會(huì)阻礙酶對(duì)底物的水解.因此，綜合考慮，可選擇加酶量為8 000 U/g，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖4　加酶量對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.2.4卵清白蛋白水解物的電泳分析

不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)水解物的電泳分析如圖5所示.由圖5可知，四種酶解液的分子量分布均有不同程度地降低，其中，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，水解物分子量小于27 kDa的分布更為集中，分子量相對(duì)較小.和單因素實(shí)驗(yàn)酶解底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的結(jié)果相符合，即水解物的DPPH自由基清除能力和水解度均較高.

β-CN為β-酪蛋白；5%、4%、3%、2%分別代表水解液的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；BSA為牛血清白蛋白 圖5　胃蛋白酶酶解液電泳圖譜

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，所得正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2所示.

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，通過(guò)極差分析得到影響DPPH自由基清除能力和水解度各因素的先后順序均為A>C>B，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)>加酶量>酶解時(shí)間.由R值比較可以看出，影響卵白蛋白DPPH自由基清除率和水解度的最優(yōu)組合均為A2B2C2，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、酶解時(shí)間5 h、加酶量為9 000 U/g.該組合在表中未涉及，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)得該條件下DPPH自由基清除率和水解度分別為89.2%、83.9%.因此，確定最佳組合為A2B2C2.

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間5 h、加酶量9 000 U/g的酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表3所示.

表3　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間5 h、加酶量9 000 U/g條件下，胃蛋白酶水解卵白蛋白的DPPH自由基清除率達(dá)到89.2%、水解度為83.9%.自由基清除率高于其它實(shí)驗(yàn)組，因此，此條件為最佳酶解工藝條件.

3討論

蛋清和蛋黃中都存在過(guò)敏原，但主要存在于蛋清中[17].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)胃蛋白酶水解卵清蛋白制備抗氧化活性肽，一方面可降低蛋清過(guò)敏原性，另一方面可產(chǎn)生抗氧化活性肽.從雞蛋中提取卵清蛋白并水解，水解物水解度高，可作為功能食品添加劑應(yīng)用于食品加工中.

畢井輝等[18]通過(guò)不同的蛋白酶處理卵清蛋白后得到水解物，并檢測(cè)其水解度，五種不同的酶的水解度最大值基本都保持在20%左右；徐明生和沈勇根等[19,20]用胃蛋白酶水解卵白蛋白，均得到了3個(gè)抗氧化活性多肽，分子量集中在450左右，超氧陰離子和羥基自由基的清除率分別為45%和56%；Tanzadehpanah等[21]利用胃蛋白酶水解鴕鳥(niǎo)蛋蛋清獲得一個(gè)12肽，此多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在20μg/mL時(shí)，亞油酸自氧化抑制率為86.4%，在200μg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率達(dá)到81%.有研究認(rèn)為C-或N-末端的疏水性Leu能夠促進(jìn)多肽與脂肪酸之間的相互作用，進(jìn)而起到抗氧化作用[22]；Chen等[23]用不同的酶酶解雞蛋蛋清，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物的抗氧化性受水解時(shí)間和酶類(lèi)型的影響；鄭云等[24]選用四種蛋白酶水解卵清白蛋白，通過(guò)正交試驗(yàn)最終確定中性蛋白酶為水解的最佳用酶，且水解度可達(dá)到81.3%；唐文婷等[25]采用胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解，對(duì)其水解產(chǎn)物進(jìn)行了體外抑菌實(shí)驗(yàn)和抗氧化能力測(cè)定，其DPPH自由基清除能力達(dá)到了85%左右；蔣雪薇等[26]研究了不同因素對(duì)卵白蛋白水解的影響，其水解度到達(dá)50.1%；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化胃蛋白酶水解條件，得到了相對(duì)較高的DPPH自由基清除率和水解度.

4結(jié)論

胃蛋白酶對(duì)卵白蛋白的水解能力較強(qiáng)，通過(guò)優(yōu)化得出了卵白蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解得到抗氧化活性肽的最佳工藝條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間5 h、加酶量9 000 U/g.此時(shí)，DPPH自由基清除率和水解度分別為89.2%和83.9%.

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【責(zé)任編輯：晏如松】

Preparation and antioxidant activity of peptides derived from ovalbumin

XUE Hai-yan, WANG Zhan-yong, SONG Hong-xin， LI Shan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Ovalbumin was one of the major allergen in egg white.And the pepsin hydrolysis can reduce allergens.In the work,peptides with antioxidant activity were prepared from ovalbumin by using DPPH radical scavenging activities and degree of hydrolysis as index.The influence of substrate concentration,enzymolysis time,and enzyme concentration on the antioxidant activity of peptides was also researched.Orthogonal experiment showed the most suitable condition of alkalineprotease to hydrolyze ovalbumin was substrate concentration of 4%,enzymolysis time of 5 h,alkaline protease of 9 000 U/g,respectively.Under the conditions,DPPH radical scavenging rates and degree of hydrolysis were 89.2% and 83.9%, respectively.So ovalbumin hydrolysates can be used as antioxidant and albumin nutrient containing amino acids,which can be widely applied in food,medicine,and other fields.

Key words:ovalbumin； pepsin； antioxidant activity； degree of hydrolysis

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2016)03-0126-06

作者簡(jiǎn)介:薛海燕(1979-)，女，陜西興平人，副教授，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301405)； 陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTZB02-02-05(2))； 陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16JK1088)； 西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CXY1434(4))

收稿日期:2016-03-28