一株降解淀粉填充聚乙烯放線菌的篩選以及誘變選育

何紅，劉沛，羅貝旭，張爾亮*，陶宗婭，亓守美，竹文坤

一株降解淀粉填充聚乙烯放線菌的篩選以及誘變選育

何紅1，劉沛1，羅貝旭1，張爾亮1*，陶宗婭1，亓守美1，竹文坤2

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610066;2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川綿陽621010)

目前對聚乙烯降解菌的研究主要集中在細(xì)菌和真菌中，放線菌作為聚乙烯降解菌株還鮮有報道.利用添加改良淀粉聚乙烯粉末為唯一碳源和能源的無碳源培養(yǎng)基，從土壤中分離篩選得到一株可以降解淀粉聚乙烯的降解菌LBX－2，通過形態(tài)學(xué)觀察生理生化反應(yīng)，結(jié)合16SrDNA序列進(jìn)行分類鑒定，菌株LBX－2與Streptomyces albogriseolus的親緣關(guān)系最近，形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)也與之相符，初步鑒定為白淺灰鏈霉菌.以篩選得到的降解菌LBX－2作為出發(fā)菌株，采用吖啶橙－紫外線復(fù)合誘變的方法進(jìn)行誘變選育，吖啶橙最佳誘變劑量為1×10－2g/mL，紫外線最佳誘變持續(xù)時間為50 s，誘變株較之原始菌株降解能力提高了41.80%，是一株具有研究和應(yīng)用潛力的降解淀粉聚乙烯的菌株.

淀粉聚乙烯;放線菌;降解;復(fù)合誘變

聚乙烯是乙烯經(jīng)聚合而成的熱塑性樹脂.具有耐低溫、耐酸堿、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)良特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)田塑料生產(chǎn)當(dāng)中，是全球用量最大的塑料品種之一［1］，但是聚乙烯塑料由于分子量大、疏水性強(qiáng)、表面能低［2］以及缺乏被微生物酶系統(tǒng)所利用的官能團(tuán)［3］等原因?qū)е缕湓谧匀画h(huán)境中降解速度非常緩慢，長期大量的積累造成了“白色污染”，嚴(yán)重危害著生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展，因此，塑料廢棄物的污染治理問題備受關(guān)注.

淀粉聚乙烯是為消除白色污染而最早研制開發(fā)的降解塑料制品之一，淀粉價格低廉且易于得到，淀粉通過改性處理后，能與聚乙烯以一定比例混合，改良淀粉降解后不會對環(huán)境造成污染，而且添加淀粉對聚乙烯的降解具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用［4］.

目前國內(nèi)外已報道的聚乙烯降解微生物主要以細(xì)菌和真菌為主［1］，放線菌作為聚乙烯降解菌株被分離出來還鮮有文章.在本研究中，一株淀粉聚乙烯粉末降解菌Streptomyces albogriseolus從土壤中分離篩選出，這對于豐富聚乙烯降解菌種資源以及促進(jìn)土壤微生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能源循環(huán)都具有一定的意義，并通過吖啶橙－紫外線復(fù)合誘變，以期望篩選到淀粉聚乙烯降解效率更高的突變菌株.

1 材料與方法

1.1淀粉聚乙烯粉末聚乙烯粉末，經(jīng)實(shí)驗室鑒定淀粉含量為30%.

1.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基A:蛋白胨10 g、石蠟油0.1 mL、K2HPO40.7 g、KH2PO40.7g、MgSO4·7H2O 0.7 g、NH4NO31.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·H2O 0.001 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2.

基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基［5］:K2HPO40.7 g、KH2PO40.7 g、MgSO4·7H2O 0.7 g、NH4NO31.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·H2O 0.001 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1 000 mL.

曲利苯藍(lán)培養(yǎng)基:曲利苯藍(lán)0.075 g、可溶性淀粉10 g、(NH4)2SO42.5 g、蛋白胨5 g、MgSO4· 7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.025 5 g、CaCl20.013 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.5.

1.3土壤梯度稀釋液的制備稱取10 g填埋有聚乙烯殘膜的土壤制成梯度稀釋液［6］，取10－4、10－5和10－63個梯度［7］的稀釋液放于4℃下冷藏保存待用.

1.4聚乙烯實(shí)驗樣品的預(yù)處理取聚乙烯粉末，放在無菌操作臺上紫外滅菌2 h，取滅菌后的聚乙烯接種在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基上，均無菌落生長，視為滅菌徹底.

1.5聚乙烯粉末降解菌的分離將保存的10－4、10－5、10－63個梯度的土壤稀釋液0.1 mL分別加入到100 mL培養(yǎng)基A中進(jìn)行富集培養(yǎng)，每個梯度3次重復(fù)，在37℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng).培養(yǎng)數(shù)天后分別轉(zhuǎn)種于含0.1 g聚乙烯粉末的100 mL基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中，每個梯度做3次重復(fù);在37℃、150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間每10 d補(bǔ)充新鮮無菌的培養(yǎng)液.60 d后選出2瓶長勢較好的混合液，再分別從中吸取0.1 mL菌液轉(zhuǎn)接到含0.1 g粉末100 mL基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 d，得到混合液A和混合液B.用接種環(huán)分別蘸取混合液A、B中的菌液接種于含有0.12 g聚乙烯粉末的基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基(pH 6.0)上，在28℃下恒溫培養(yǎng)，15 d后平板上長出了菌落，將培養(yǎng)基長出的不同菌落在基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基劃線分離純化，直至每個平板上長出單一的優(yōu)勢菌株，選取長勢最好的一株菌，命名為LBX－2.

1.6菌株鑒定1)形態(tài)學(xué)觀察:參照文獻(xiàn)［8］，觀察氣生菌絲在不同培養(yǎng)基上的顏色變化情況，以及在普通光學(xué)顯微鏡下的孢子和孢子絲的形態(tài)觀察.

2)生理生化鑒定:明膠液化實(shí)驗、牛奶胨化實(shí)驗、淀粉水解實(shí)驗、酪氨酸水解實(shí)驗、不同碳源利用實(shí)驗［9－10］.

3)16SrDNA的全序列克隆測序:將已純化的菌株送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行16SrDNA全序列的克隆測序.測序結(jié)果放入Genebank中進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，找出和菌株LBX－2親緣關(guān)系最近的種.

1.7聚乙烯降解測定方法

1.7.1 淀粉含量的變化參照文獻(xiàn)［11］計算淀粉含量的變化.

1.7.2 失重法挑取一環(huán)LBX－2菌落于高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)5 d，再以1%的接種量接種到含有0.5 g的100 mL基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中，空白組不接種菌，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)15 d.收集未降解完的聚乙烯粉末，先用超純水清洗數(shù)遍，再用超聲波清洗儀進(jìn)行清洗，后將其置于烘箱中直至恒重，取出稱量，利用公式計算其失重率.

1.8吖啶橙－紫外線復(fù)合誘變

1.8.1 菌懸液的制備取培養(yǎng)至對數(shù)期的LBX－2斜面一支，小心將抱子和菌體刮下，置于裝有無菌水的三角瓶中，加入滅菌的玻璃珠20粒，置于200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，振蕩6 h，使菌體的分散率達(dá)到90%左右，隨后用8層無菌紗布對孢子懸液過濾，鏡檢菌懸液中的菌體數(shù)，使孢子濃度保持約為107～108個/mL.

1.8.2 吖啶橙誘變準(zhǔn)確稱取吖啶橙，以無菌水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的工作溶液，以0.22 μm膜過濾除菌備用.將1%吖啶橙溶液進(jìn)行稀釋，加入到高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基中，稀釋最終質(zhì)量濃度為:1×10－1、1× 10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5g/mL 5種［12］，取菌液3 mL分別加入100 mL吖啶橙－高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基中，每個質(zhì)量濃度3個平行，置于32℃恒溫振蕩箱培養(yǎng).5 d后取上述處理過的菌懸液0.1 mL，稀釋到10－4、10－52個稀釋梯度涂平板，于32℃中避光培養(yǎng)5 d，計算致死率和正突變率［13］.

1.8.3 紫外線誘變將吖啶橙處理后得到的最優(yōu)性狀突變株制成菌懸液準(zhǔn)備誘變，誘變在黑暗中進(jìn)行，其他操作在紅光下進(jìn)行.在正式誘變前，先將紫外燈開啟至254 nm，進(jìn)行30 min的預(yù)熱，取3 mL菌液于直徑為9 cm的平皿內(nèi)，照射時間分別為: 10、20、30、40、50、60、70 s(照射距離20 cm)，每照射10 s后將菌液攪勻，照射時間累計.將誘變后的菌懸液避光放置1 h，得到最佳紫外波長下，照射時間不同誘變效果曲線.

1.8.4 篩選將誘變菌株接入曲利苯藍(lán)培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，在32℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察透明圈，挑選透明圈大的菌株.將初篩得到的菌株，接入淀粉聚乙烯為唯一碳源的基礎(chǔ)無碳源固體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，并測定其淀粉水解酶的活性.

1.8.5 致死率以及正突變率的計算按照以下公式計算誘變菌株的致死率以及正突變率

2 結(jié)論

2.1菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)以及生理生化鑒定觀察菌株在改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、馬鈴薯塊、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基上的顏色變化情況如表1所示.

表1 不同培養(yǎng)基中的氣絲顏色情況Table 1Colour change of the aerial mycelium in different culture media

在熒光顯微鏡下觀察孢子和孢子絲的形態(tài)，觀察結(jié)果如圖1所示，孢子呈現(xiàn)卵圓形，孢子絲呈螺旋形.

2.1.2 菌株的分子學(xué)鑒定根據(jù)16SrDNA的全序列克隆測序的結(jié)果，全序列總長為1 517 bp.菌株LBX－2與Streptomyces albogriseolus的親緣關(guān)系最近;同時形態(tài)學(xué)的觀察和生理生化指標(biāo)也與之相符，因此菌株LBX－2被鑒定為Streptomyces albogriseolus.

2.2降解特性天然淀粉與聚烯烴的相容性極差，難于加工合成，通過對天然淀粉的改性或者是添加增溶劑，可以提高其與聚乙烯的相容性.淀粉聚乙烯里的淀粉在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上都與天然的淀粉有一定的區(qū)別.根據(jù)文獻(xiàn)［2］，得到淀粉聚乙烯塑料顆粒中淀粉的變化，降解前淀粉含量為30%，降解15天后淀粉減少了14.77%，占淀粉總含量的49.23%，淀粉聚乙烯失重率達(dá)到26.54%，通過計算得出淀粉聚乙烯減少了11.77%，占聚乙烯總量的16.81%.

表2 生理生化指標(biāo)結(jié)果Table 2The characteristics of physiological and biochemical index

2.3復(fù)合誘變

2.3.1 吖啶橙誘變篩選突變株吖啶橙的誘變結(jié)果如圖3所示，當(dāng)處理濃度為1×10－2g/mL時，致死率達(dá)到70.08%，獲得最大正向突變率為21.30%，隨著處理濃度的增加，致死率增加，當(dāng)處理濃度達(dá)到1 ×10－1g/mL時，致死率幾乎達(dá)到了100%.以前認(rèn)為致死率在90%～99.9%效果好.但是目前的報道認(rèn)為致死率在70%～80%有利于正突變型的產(chǎn)生，且篩選的菌株遺傳穩(wěn)定性好.從致死率70.08%的培養(yǎng)基中共挑出60個單菌落，從中再挑出菌落色澤和粘度有異于原始菌株的菌落20個，編號為H1～H20，用曲利苯藍(lán)培養(yǎng)基透明圈法進(jìn)行初篩，挑選抑菌圈大和抑菌圈透明的菌株.經(jīng)此法初篩，共得到10株透明抑菌帶大于原始菌株的菌株，挑取此10個菌落，在添加聚乙烯為唯一碳源的基礎(chǔ)無碳源培養(yǎng)基上復(fù)篩，對其中性能優(yōu)良的3株進(jìn)行淀粉酶活力測定，最終得到一株菌H－9，降解淀粉聚乙烯能力相對較強(qiáng)，比原始菌株淀粉酶活力提高，故將H－9作為第二次誘變(UV誘變)的出發(fā)菌株.

2.3.2 紫外誘變紫外線對H－9的誘變效應(yīng)如圖4所示.在照射時間為50 s時致死率達(dá)到83.43%，獲得最大正向突變率為19.79%，隨著處理濃度的增加，致死率增加，當(dāng)處理時間達(dá)到70 s時，致死率幾乎達(dá)到了100%.從照射時間50 s的培養(yǎng)基中共挑出50個單菌落，從中再挑出菌落色澤和粘度有異于原始菌株的菌落17個，編號為HH1～HH17.用曲利苯藍(lán)培養(yǎng)基透明圈法進(jìn)行初篩，挑選抑菌圈大和抑菌圈透明的菌株.經(jīng)此法初篩，共得到6株透明抑菌帶大于原始菌株的菌株，挑取平板菌落共計4個，在添加聚乙烯為唯一碳源的基礎(chǔ)無碳源培養(yǎng)基上復(fù)篩，對其中性能優(yōu)良的2株進(jìn)行淀粉酶活力測定，最終得到一株菌HH－14，降解淀粉聚乙烯能力相對較強(qiáng)，較原始菌株淀粉酶活力提高.

2.4突變株HH－14與原始菌株LBX－2的降解特性比較原始株LBX－2與突變株LBXH－14，等量接種到含有0.5 g的100 mL基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)15 d，具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3.

表3 原始菌株與突變菌株降解淀粉聚乙烯效果比較Table 3The different degradation effect of the original strain and the mutant strain

本實(shí)驗通過從填埋聚乙烯膜的土壤中篩選到一株可以降解聚乙烯粉末的菌株，能在聚乙烯為唯一碳源的基礎(chǔ)無碳源培養(yǎng)基上生長，通過16SrDNA同源性比對，鑒定其為放線菌Streptomyces albogriseolus，通過化學(xué)誘變與物理誘變相結(jié)合的方法對LBX－2進(jìn)行誘變，最終獲得一株高效降解淀粉聚乙烯的突變株HH－14，較之原始菌株，降解效果提高了41.8%，這株高效降解菌為今后生物降解聚乙烯提供了良好的研究基礎(chǔ).

3 討論

在可生物降解塑料領(lǐng)域中，淀粉聚乙烯的應(yīng)用越來越廣泛，淀粉聚乙烯被視為是減輕或消除塑料制品對環(huán)境危害的重要手段之一，但是目前對聚乙烯降解菌的研究主要集中在真菌和細(xì)菌當(dāng)中，鄭連爽等［14］研究黑曲霉、繩狀青霉在受控條件下，對聚乙烯膜的降解量與添加的淀粉呈正相關(guān).還有真菌中的Aspergillus flavus［15］、Penicillium simplicissimum YK［16］都被證明能夠降解淀粉聚乙烯.S.Bonhomme等［17］研究細(xì)菌中的Rhodococcus rhodochrou，K.Yamada－Onodera等［16］研究細(xì)菌中的Brevibacillus borstelensis，都被證明能分解并利用聚乙烯供菌體自身生長［18］，而對放線菌降解淀粉聚乙烯的報道卻很少有，本研究篩選出來的放線菌，能在一定程度上豐富聚乙烯降解菌種資源，對探究聚乙烯降解機(jī)理起到很好的輔助作用.

一般認(rèn)為，復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，以多種誘變方法進(jìn)行復(fù)合誘變，可以加大誘變范疇［19］.本實(shí)驗通過吖啶橙－紫外線復(fù)合誘變的方法，選育出一株高效降解淀粉聚乙烯的菌株，較之出發(fā)菌株，聚乙烯的降解能力提高了41.8%，鄭連爽等［14］利用5株混合真菌在受控試驗條件下，對淀粉含量6%～18%的聚乙烯進(jìn)行降解研究，28 d其降解質(zhì)量變化率不超過3.2%，低于本研究Streptomyces albogriseolus對淀粉的降解效果，說明該菌株對淀粉聚乙烯中的改良淀粉具有良好的降解能力.與陸辰霞等［20］篩選出一株解淀粉芽孢桿菌，2周降解9.4%聚乙烯的降解量相比，平均降解速率低于本研究菌株的降解速率，說明本菌株具有良好的降解淀粉聚乙烯的能力，并對淀粉聚乙烯中的聚乙烯具有一定的降解潛力.

在純聚乙烯中添加淀粉，能獲得可生物降解塑料，淀粉的加入加快了聚乙烯的降解速率，而導(dǎo)致聚乙烯降解的原因很可能是淀粉對聚乙烯生物降解起到了促進(jìn)作用，而不是淀粉本身被生物降解利用［4，21］，目前降解機(jī)理尚不明了，探索工作正在進(jìn)行中.

致謝西南科技大學(xué)生物質(zhì)材料教育部工程研究中心(11zxbk03)對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.

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Isolation and Complex Mutagenesis of an Actinomycetes with Degraded Starch/Polyethylene Powder

HE Hong1，LIU Pei1，LUO Beixu1，ZHANG Erliang1，TAO Zongya1，QI Shoumei1，ZHU Wenkun2
(1.College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan; 2.College of Life Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan)

At present，the research of polyethylene degradation bacteria mainly focused on the bacteria and fungi，while actinomycetes as degradation strains are rarely reported.In this article，modified Starch/polyethylene powder as sole carbon and energy source were employed.A strain LBX-2 which can degrade starch/polyethylene was isolated from soil and identified by the phenotypic to abtain，physiological and biochemical characteristics.With 16SrDNA gene cloned sequence，the isolated strain LBX-2 was identified to be closely related to Streptomyces albogriseolus.Phenotypic，physiological and biochemical characteristics are the same with Streptomyces albogriseolus.With LBX-2 as the starting stain by using acridine orange and UV irradiation treatment，the best mutagenic effect was proved through experiment 1×10－2g/mL after mutated with acridine orange and 50 s ultraviolet radiation.The isolated strains named Streptomyces albogriseolus can degrade starch/polyethylene powder after complex mutation with acridine orange and ultraviolet radiation，and the degradation capacity can be improved 41.80%higher than that of the original strain.Thus，it is a valuable and potential strain in the research of degradation of Starch/polyethylene powder.

starch/polyethylene;actinomycetes;degradtion;complex mutation

R379.1Q939.96

A

1001－8395(2016)03－0408－06

10.3969/j.issn.1001－8395.2016.03.019

(編輯鄭月蓉)

2015－01－31

國家“十一五”科技支撐計劃項目子課題(2007BAE42B04－01)和四川省教育廳重點(diǎn)課題(11ZA096)

*通信作者簡介:張爾亮(1959—)，男，教授，主要從事微生物學(xué)與生物化學(xué)的研究，E－mail:1074356205@qq.com