反復(fù)心肌缺血致心肌梗死模型的制備＊

魏 蕓，嚴(yán)素玉，張彩峰，張碩峰

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

反復(fù)心肌缺血致心肌梗死模型的制備＊

魏 蕓，嚴(yán)素玉，張彩峰，張碩峰＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：本研究通過大鼠反復(fù)心肌缺血并疊加冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)建立反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型。方法：通過大鼠尾靜脈反復(fù)緩慢推注垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血，疊加冠狀動脈左前降支結(jié)扎手術(shù)建立大鼠反復(fù)心肌缺血致心肌梗死模型。以心電圖、生化指標(biāo)[肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及心肌梗死范圍]為指標(biāo)，確定最佳造模條件。以通心絡(luò)膠囊為陽性藥，以生化指標(biāo)肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及心肌梗死范圍為指標(biāo)驗(yàn)證該模型用于評價中藥治療心肌缺血的可行性。結(jié)果：垂體后葉素15 U·kg-1給藥后與7.5 U·kg-1比較大鼠心肌缺血出現(xiàn)所需時間較短，心肌缺血持續(xù)時間均可穩(wěn)定在20 min以上，與30 U·kg-1比較動物死亡率低；垂體后葉素給藥3天，心肌缺血持續(xù)時間均可穩(wěn)定在30 min以上，與假手術(shù)組比較心肌酶顯著升高，動物死亡率低。通心絡(luò)膠囊組與模型組比較心肌梗死體積顯著減?。≒＜0.05）、血清酶LDH、CK-MB、ALT活性值明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：大鼠尾靜脈推注垂體后葉素15 U·kg-1，反復(fù)給藥3天為最佳造模條件。大鼠反復(fù)心肌缺血致心肌梗死模型適于評價中藥的抗心肌缺血作用。

大鼠 反復(fù)心肌缺血 心電圖 垂體后葉素

心肌缺血是心臟的血液灌注減少，從而導(dǎo)致心臟供氧減少，心肌能量代謝異常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)，是世界范圍普遍的疾病[1-3]，心肌缺血進(jìn)一步發(fā)展將導(dǎo)致冠心病、心肌梗死等一系列心血管類疾病,這類疾病在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家有很高的發(fā)病率和死亡率[4,5]?？剐募∪毖幬锏难芯渴悄壳搬t(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，而建立可靠的動物模是藥物研究的基礎(chǔ)。型目前評價藥物抗心肌缺血作用的動物模型大致可分為以下幾類：急性心肌缺血模型[6-8]、慢性心肌缺血模型[9]、可控性心肌缺血模型[10]。慢性心肌缺血模型造模時間長，成本高昂；可控性心肌缺血模型雖具有與人類的發(fā)病機(jī)制與病程發(fā)展相近似的優(yōu)點(diǎn)，但操作難度大，需要專門的設(shè)備和技術(shù)支持；急性心肌缺血模型具有操作簡單，成模時間短的優(yōu)點(diǎn)，是最常用的動物模型，但此種方法的治療時間窗短，與臨床中藥防治心肌缺血使用情況不符，為使中藥在抗心肌缺血領(lǐng)域的早期預(yù)防、早期治療的優(yōu)勢作用得到體現(xiàn)，本研究模擬臨床病人心肌缺血反復(fù)發(fā)作，最終發(fā)展為心肌梗塞的病理過程，建立了大鼠反復(fù)心肌缺血致心肌梗死模型，為抗心肌缺血中藥的研發(fā)提供一種符合臨床中藥使用特點(diǎn)的可靠的研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量180-200 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號為SYXK（京）2011-0024。

1.1.2 藥品與試劑

垂體后葉素注射液，規(guī)格6 U/2 mL（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：130702）；紅四氮唑TTC（北京化工廠，批號 0140402）；肌酸激酶同工酶（南京建成生物工程研究所，批號20150427）；乳酸脫氫酶（南京建成生物工程研究所，批號20150413）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（南京建成生物工程研究所，批號20150413）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（南京建成生物工程研究所，批號20150425）；試通心絡(luò)膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號A1405019）。

1.1.3 主要儀器

JS-B微量注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；RM6240C多通道生理采集系統(tǒng)（成都儀器廠）；DW3000呼吸機(jī)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；GL-21高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）有限公司]；HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型條件的確定

1.2.1.1 垂體后葉素尾靜脈推注最佳給藥劑量的選擇

①分組

取30只大鼠隨機(jī)分為3組，垂體后葉素用量分別為：7.5、15.0、30.0 U·kg-1。

②造模方法

腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；使用微量注射泵以0.167 mL·min-1速度分別經(jīng)尾靜脈緩慢推注垂體后葉素7.5、15、30 U·kg-1（約6 min），根據(jù)心電圖觀察給藥結(jié)束后大鼠心肌缺血出現(xiàn)時間、心肌缺血持續(xù)時間以確定最佳給藥劑量。大鼠心電圖出現(xiàn)以下各項(xiàng)作為心肌缺血的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：T波高聳，超過同導(dǎo)聯(lián)R波1/2；ST段上抬或下移＞0.1 mV；T波高聳伴有ST段移位；P波消失；T波倒置。心肌缺血持續(xù)時間的計(jì)算以下移ST段、倒置T波、上抬ST段三者之一恢復(fù)至初始值50%的時間為準(zhǔn)。

1.2.1.2 垂體后葉素最佳給藥次數(shù)的選擇

①分組

取SD大鼠50只隨機(jī)分為5組：垂體后葉素組（給藥1、2、3、4天）、假手術(shù)組。

②造模方法

垂體后葉素各組按“1.2.1.1”的參數(shù)尾靜脈推注垂體后葉素15 U·kg-1，每天1次，分別注射1、2、3、4天，最后一次注射垂體后葉素時記錄大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，采集大鼠心肌缺血出現(xiàn)時間、心肌缺血持續(xù)時間、惡性心律失常出現(xiàn)例數(shù)（包括室性早搏、心房撲動）。24 h后，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；經(jīng)口氣管插管，連接動物呼吸機(jī)（呼吸頻率60 次/min，潮氣量6 mL），于左側(cè)第四肋間開胸，用6/0絲線在肺動脈圓錐和左心耳交界下緣1-2 mm 結(jié)扎，以結(jié)扎部分紫紺和心電圖ST段抬升作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。手術(shù)后觀察10 min，擠出胸腔內(nèi)空氣并逐層關(guān)胸，恢復(fù)大鼠自主呼吸，拔出氣管插管并清除氣管內(nèi)分泌物，回籠飼養(yǎng)。

③指標(biāo)檢測

造模24 h后，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，腹主動脈取血，并迅速取出心臟，置冰冷生理鹽水中沖洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌組織，置于-20℃冰箱放置10 min。在心臟結(jié)扎線下，平行冠狀溝將心臟自心尖至心底部橫切成4-5 片（厚約1.5-2 mm），置于1% TTC磷酸鹽緩沖液中（pH 7.4）于37℃空氣浴中孵育10 min。將染色后的心臟切片置于4%多聚甲醛溶液中固定，掃描心臟切片的正反兩面，用Image-Pro Plus 7.0C 軟件測量每片心臟切片及梗死部位的面積，并計(jì)算心室體積及梗死體積，梗死范圍以梗死體積占全心室體積的百分比表示。血液于3 000 rpm 離心15 min（4℃），得到血清樣品，凍于-80℃冰箱備用，以測定血清心肌酶譜檢測包括肌酸激酶（CK）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性。

1.2.2 通心絡(luò)膠囊對大鼠反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型的影響

1.2.2.1 分組及給藥

SD大鼠30只隨機(jī)分為3組：模型組、通心絡(luò)膠囊組、假手術(shù)組。通心絡(luò)膠囊組自造模開始第一天起每天灌胃給予通心絡(luò)膠囊2次（每次160 mg·kg-1），給藥容積1 mL/100 g體重，連續(xù)給藥3天，于結(jié)扎冠狀動脈脈前30 min灌胃給藥一次，結(jié)扎后6 h再灌胃給藥一次。假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量飲用水，給藥容積1 mL/100 g體重。

1.2.2.2 造模方法

按“1.2.1.1”的參數(shù)尾靜脈緩慢推注垂體后葉素15 U·kg-1，每日一次，共3次，第4天腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（37 mg·kg-1）麻醉大鼠結(jié)扎左冠脈左前降支。假手術(shù)組尾靜脈緩慢推生理鹽水，在冠狀動脈左前降支相應(yīng)位置穿針而不打結(jié)，其余操作與模型組一致。

1.2.2.3 指標(biāo)檢測

計(jì)算大鼠心肌梗死體積、檢測血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）酶活性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型條件的確定

2.1.1 垂體后葉素尾靜脈推注最佳給藥劑量的選擇

結(jié)果顯示隨著垂體后葉素劑量的增加，大鼠出現(xiàn)心肌缺血的潛伏期越短，心肌缺血持續(xù)的時間越長。其中垂體后葉素30 U·kg-1給藥后立刻出現(xiàn)心肌缺血，持續(xù)時間超過60 min，并導(dǎo)致部分動物死亡；垂體后葉素7.5 U·kg-1給藥后心肌缺血持續(xù)時間較短；垂體后葉素15 U·kg-1給藥后心肌缺血出現(xiàn)所需時間較短，心肌缺血持續(xù)時間均可穩(wěn)定在20 min以上。故認(rèn)為尾靜脈推注垂體后葉素15 U·kg-1為最佳劑量。詳見表1。

表1 不同劑量垂體后葉素靜脈注射對大鼠心肌缺血程度的影響

表1 不同劑量垂體后葉素靜脈注射對大鼠心肌缺血程度的影響

2.1.2 垂體后葉素最佳給藥次數(shù)的選擇

結(jié)果顯示，大鼠尾靜脈推注垂體后葉素15 U·kg-1，隨著給藥次數(shù)的增加，大鼠心肌缺血出現(xiàn)的潛伏期愈來愈短，心肌缺血持續(xù)時間愈來愈長，給藥3次以上，心肌缺血持續(xù)時間均可穩(wěn)定在30 min以上；給藥4次時，80.0%的動物出現(xiàn)惡性心律失常，并有30.0%的動物死亡；結(jié)扎冠狀動脈前降支后各組動物均出現(xiàn)心肌梗死，且梗塞范圍接近，血清心肌酶亦有不同程度的升高（與假手術(shù)組比較P＜0.05），其中反復(fù)給藥3天，心肌酶升高幅度較小。故垂體后葉素15 U·kg-1反復(fù)給藥3天為最佳造模條件。詳見表2-表4。

表2 垂體后葉素15 u·kg-1多次靜脈注射給藥對大鼠心電圖的影響

表2 垂體后葉素15 u·kg-1多次靜脈注射給藥對大鼠心電圖的影響

注：*惡性心律失常包括室性早搏、心房撲動。

2.2 通心絡(luò)膠囊對大鼠反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型的影響

結(jié)果顯示，大鼠尾靜脈推注垂體后葉素15 U·kg-1，反復(fù)給藥3天并結(jié)扎冠狀動脈前降支后各組動物均出現(xiàn)心肌梗死，血清CK-MB、ALT、LDH活性顯著升高（與假手術(shù)組比較P＜0.05）。通心絡(luò)膠囊可使心肌梗死范圍明顯減少，大鼠血清CK-MB、LDH、ALT活性均顯著降低（與模型組比較P＜0.05）。詳見表5-表6。

3 討論與結(jié)論

垂體后葉素是從動物腦垂體后葉提取的一種水溶性物質(zhì)，垂體后葉素包含血管加壓素和縮宮素兩種活性成分[11]，大劑量的垂體后葉素可引起冠狀動脈、毛細(xì)血管、小動脈及小靜脈痙攣性的收縮，導(dǎo)致心臟灌流不足，耗氧量明顯增加，造成心肌缺血、缺氧[12,13]。注射垂體后葉素致大鼠心肌缺血模型被廣泛用于抗心肌缺血藥物的篩選和評價[14]。本研究采用反復(fù)靜脈給與垂體后葉素15 U·kg-13天致大鼠反復(fù)心肌缺血的方法，并加以中藥進(jìn)行干預(yù)，模擬臨床患者長期心肌缺血的病理過程和使用中藥的治療過程；結(jié)合結(jié)扎大鼠左冠脈左前降支方法致心肌梗死，模擬臨床患者長期心肌缺血發(fā)展為心肌梗死的病理過程，并以心肌梗死范圍、心肌酶作為中藥干預(yù)作用的評價指標(biāo)建立動物模型,為抗心肌缺血中藥的研發(fā)提供一種符合中藥臨床用藥特點(diǎn)的動物模型。

通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論研制而成的中藥復(fù)方制劑，由人參、土鱉蟲、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、降香、赤芍、冰片等藥物組成，具有通絡(luò)活血、緩急止痛及益氣養(yǎng)陰之功效[15]。臨床用于冠心病心絞痛，研究證實(shí)其治療冠心病心絞痛的臨床有效性及心電圖有效性與目前臨床常用的硝酸酯類藥物相當(dāng)[16]。故本研究選用通心絡(luò)膠囊來驗(yàn)證該模型用于評價中藥治療心肌缺血的可行性。

研究結(jié)果表明顯示，通心絡(luò)膠囊治療給藥4天后可使心肌梗死范圍減少29.5%，大鼠血清CKMB、LDH、ALT活性亦顯著降低，表明通心絡(luò)膠囊可明顯減輕缺血對心肌造成的損傷。

綜上所述大鼠反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型操作簡便、能夠充分體現(xiàn)中藥早期預(yù)防、早期治療的特點(diǎn)，適于評價中藥抗心肌缺血的作用。

表3 大鼠垂體后葉素15 U·kg-1多次靜脈注射給藥并結(jié)扎左冠脈左前降支后對心臟梗死范圍的影響/%

表3 大鼠垂體后葉素15 U·kg-1多次靜脈注射給藥并結(jié)扎左冠脈左前降支后對心臟梗死范圍的影響/%

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01。

表4 大鼠垂體后葉素15 U·kg-1多次靜脈注射給藥并結(jié)扎左冠脈左前降支后對血清酶活性的影響/U·L-1

表4 大鼠垂體后葉素15 U·kg-1多次靜脈注射給藥并結(jié)扎左冠脈左前降支后對血清酶活性的影響/U·L-1

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

表5 通心絡(luò)膠囊對反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型大鼠心肌梗死范圍影響

表5 通心絡(luò)膠囊對反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型大鼠心肌梗死范圍影響

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與反復(fù)模型組比較，#P＜0.05。

表6 通心絡(luò)膠囊對反復(fù)心肌缺血至心肌梗死模型大鼠血清酶活性的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與反復(fù)模型組比較，#P＜0.05。

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Research on Method of Repeated Myocardial Ischemia to Myocardial Infarction Model in Rats

Wei Yun, Yan Suyu, Zhang Caifeng, Zhang Shuofeng
(School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to confirm model of the repeated myocardial ischemia to myocardial infarction model in rats. The model was induced by injecting vasopressin repeatedly via the tail vein slowly for several days. And then, the left anterior descending coronary artery was ligated. The electrocardiogram (ECG), biochemical indicators (CK-MB, AST, ALT) and the myocardial infarction volume were taken as indexes for the determination of optimized conditions for the model. Tongxinluo (TXL) capsule was chosen as positive drug. Biochemical indicators, including CK-MB, LDH, ALT, and the myocardial infarction volume were used to evaluate the feasibility of Chinese medicine in anti-ischemic treatment of the new model. The results showed that in the appear time of myocardial ischemia the vasopressin 15 U·kg-1group was significantly lower than the vasopressin 7.5 U·kg-1group. The duration of myocardial ischemia was more than 20 min. The mortality rate of rats was lower compared to the vasopressin 30 U·kg-1group. After 3-day vasopressin, the duration of myocardial ischemia was more than 30 min. Compared with the sham operation group CK-MB was significantly increased with low mortality rate of rats. The myocardial infarction volume of TXL capsule group was significantly decreased compared with the model group (P＜ 0.05). The activities of serum enzymes (LDH, CK-MB and ALT) were significantly lower than model group (P＜ 0.05). It was concluded that the optimal model establishment condition was to inject 15 U·kg-1of vasopressin via the tail vein repeatedly for three days. The model of repeated myocardial ischemia to myocardial infarction model was adapted to evaluate the anti-ischemic effect of Chinese medicine.

Rat, repeated myocardial ischemia, ECG, vasopressin

10.11842/wst.2016.03.017

R318.11

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2016-01-12

修回日期：2016-01-27

＊ 科技部十二五重大新藥創(chuàng)制（2012ZX09103201-036）：三七和紅花有效組分復(fù)方配伍的候選藥物研究，負(fù)責(zé)人：姜勇。

＊＊ 通訊作者：張碩峰，副教授，主要研究方向：中藥防治心血管研究。