健脾方對克羅恩大鼠結(jié)腸NF-κBP65、IL-23和CCL20及其受體表達的影響＊

吳璐一，劉慧榮，翁志軍，陸 穎，季 光

（1.上海中醫(yī)藥大學 上海市氣功研究所 上海 200030；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3.上海中醫(yī)藥大學 脾胃病研究所 上海 200030）

健脾方對克羅恩大鼠結(jié)腸NF-κBP65、IL-23和CCL20及其受體表達的影響＊

吳璐一1，劉慧榮2，翁志軍2，陸 穎1，季 光3＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學 上海市氣功研究所 上海 200030；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3.上海中醫(yī)藥大學 脾胃病研究所 上海 200030）

目的：觀察核因子NF -κB p65信號通路介導細胞因子IL-23、趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-3α（CCL20）及其受體CCR6表達的影響，及健脾方防治三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的克羅恩病中相關(guān)作用機制。方法：24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為：①正常對照組（NG，n=8）：從造模第2周起雙蒸水灌胃，每日1次，灌胃量按0.1 mL·kg-1，共3周；②TNBS模型組（MG，n=8）：從第1周開始TNBS灌腸，灌腸劑量（mL）=體質(zhì)量（g）×0.003 ml·g-1，每周1次，造模持續(xù)共4周；③模型+健脾方防治組（JP，n=8）：從造模第2周開始，在TNBS灌腸后的第2天予以中藥健脾方灌胃治療，灌胃量按0.1 mL·kg-1，每日1次，灌胃持續(xù)3周；采用結(jié)腸組織學損傷評分及HE組織病理的方法觀察健脾方的療效，免疫熒光、ELISA、原位雜交等技術(shù)觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜中NF-κB P65、IL-23、CCL20、CCR6蛋白與基因的表達差異；結(jié)果：免疫熒光和原位雜交結(jié)果顯示，CCL20及其受體CCR6在正常組大鼠結(jié)腸中呈低表達，在模型組中呈高表達狀態(tài)（P＜0.05）。健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸趨化因子CCL20及其受體CCR6的表達水平（P＜0.05）。正常組大鼠結(jié)腸中NF-κB P65呈低表達，在模型組中呈高表達狀態(tài)（P＜0.05），健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸NF-κB P65表達水平（P＜0.05）。ELISA結(jié)果顯示IL-23在正常組大鼠結(jié)腸中呈低表達，在模型組中呈高表達狀態(tài)（P＜0.05）。健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸細胞因子IL-23的表達水平（P＜0.05）。結(jié)論：健脾方可減輕TNBS誘導的CD大鼠結(jié)腸炎癥程度，其潛在的機制與抑制NF-κB P65、IL-23和CCL20/CCR6的表達有關(guān)。

克羅恩病 NF-κB P65 IL-23 CCL20 健脾方

克羅恩病（Crohn’s disease，CD）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，趨化因子介導細胞在炎癥部位聚集、活化以及組織損傷的修復，在常規(guī)免疫監(jiān)督、炎癥、生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用[1]。趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-3α（又稱作CCL20）及其受體CCR6有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[2，3]，近年來在炎癥性腸病中備受關(guān)注。CCL20主要由表皮細胞或黏膜上皮細胞分泌，可表達于正常細胞，也可表達于異常細胞[4]。CCR6表達于淋巴與非淋巴組織，主要表達于脾臟、淋巴結(jié)、闌尾、胰腺，較少表達于外周血粒細胞、胸腺、小腸等[5-8]。NF-κB p65是參與炎癥反應的基因調(diào)控中的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與CD的發(fā)生與發(fā)展。有研究表明，CCL20是NF-κB的靶基因[4]，且NF-κB的激活可促進CCL20以及CCR6的表達。同時NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的激活，還會促IL-6、IL-21、IL-23、TNF-α等細胞因子釋放，進一步加重炎癥反應。中醫(yī)藥治療IBD的特點是多途徑、多層次、多靶點并且可以長期維持用藥治療[9，10]，越來越廣地應用于臨床，能有效緩解IBD臨床癥狀[11，12]，但其潛在的機制尚未明確，對此進行深入研究，將有助于提高臨床療效，促進臨床進一步推廣與應用。本研究采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸的方法建立CD大鼠模型，通過觀察健脾方對CD模型大鼠飲食、神態(tài)、皮毛、體質(zhì)量、排便、活動情況、反應能力等一般情況，結(jié)腸大體形態(tài)損傷及組織病理學評分，結(jié)腸細胞因子IL-23、CCL20及其受體CCR6、以及NF-κB表達，初步揭示健脾方在防治IBD的可能作用機制，為推廣健脾方在臨床預防和治療IBD方面的應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量160±10 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院實驗動物中心，所有大鼠均自由飲水（藥）、攝食，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為24±2℃，濕度為55±10%，光照時間為12 h（8：00-20：00），所有實驗對動物的處理符合中國科學技術(shù)部的相關(guān)指導建議。

1.2 模型制備

按照Morris[13]等方法制備結(jié)腸炎大鼠模型，5%TNBS與50%的乙醇按2:1比例混合而成，3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（按體質(zhì)量計，0.01 mL·kg-1），使其身體垂直，處于倒立位，每次灌腸劑量：灌腸液（mL）=體質(zhì)量（g）×0.003 mL·g-1，5 mL注射器連接灌腸針順大鼠直結(jié)腸生理曲度緩緩從肛門插入約6-9 cm，注入灌腸液。灌腸后將大鼠倒立體位約5 min。每周第1天灌腸1次，共4次，持續(xù)4周。

1.3 藥物來源及加工

健脾方由以下中藥（補骨脂15 g、茯苓9 g、白術(shù)9 g、白頭翁15 g、馬齒莧30 g、炙訶子15 g、石榴皮15 g、藿香9 g）組成，根據(jù)《中藥藥理學研究方法學》標準，將中藥加入蒸餾水中，煎煮2次，合并兩次藥液，4層紗布過濾，水浴鍋95℃濃縮體積為555.5 mL的藥液。置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)《中藥藥理學》（全國高等中醫(yī)藥院校教材《中藥藥理學》陳長勛主編，上?？茖W技術(shù)出版社，2006年10月第一版，191頁表22-3）用藥劑量按人鼠等效劑量灌胃，大鼠為0.1 mL·kg-1。

1.4 實驗分組與治療

24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為：①正常對照組（NG，n=8）：從造模第2周起雙蒸水灌胃，每日1次，灌胃量按0.1 mL·kg-1，共3周；②TNBS模型組（MG，n=8）：從第1周開始TNBS灌腸，灌腸劑量（mL）=體質(zhì)量（g）×0.003 mL·g-1，每周1次，造模持續(xù)共4周。③模型+健脾方防治組（JP，n=8）：從造模第2周開始，在TNBS灌腸后的第2天予以中藥健脾方灌胃治療，灌胃量按0.1 mL·kg-1，每日1次，灌胃持續(xù)3周。

1.5 標本采集與處理

以 3% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠（按體質(zhì)量計，0.0.1 mL·kg-1），截取距離肛門6-9 cm處病變明顯結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開，用預冷的4℃生理鹽水沖洗后，肉眼觀察并記錄黏膜損傷情況，結(jié)腸分為兩部分保存，一部分置于液氮保存，一部分用10%的中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋組織，切片厚度為4 μm。所有實驗對動物的處理符合中國科學技術(shù)部指導建議。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 大鼠結(jié)腸組織損傷評分和HE染色

HE染色步驟：①切片常規(guī)脫蠟至水；②蘇木素1 min；③鹽酸酒精2 s；④伊紅10 s；⑤二甲苯透明；⑥中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.6.2 大鼠結(jié)腸CCL20、CCR6、NF-κB P65原位雜交檢測

試劑盒采用針對C-C motif chemokine 20（MIP3α）、CCR6、NF-κB P65的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標記（武漢博士德公司）。由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術(shù)，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法，可以檢測出常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋標本的MIP3α、CCR6、NF-κB P65之mRNA序列。針對大鼠MIP3α靶基因的mRNA 序列為：①5’-TACAC AAAGA ACGTG TATCA TCATG CGAGA AATTT-3’；②5’-CAGAT GGCCG ACGAA GCTTG TGACA TTAAT GCTAT-3’；③5’-TGCGC TGACC CAAAG CAGAT CTGGG TGAAA AGGAT-3’。針對大鼠CCR6 靶基因的mRNA 序列為：①5’-CATGC CACTG ACACT TGGAT CTTTG GCAAC ACGAT-3’；②5’-TTCTT CAACA AGCAA TACAA GCTGC AGGGC CGTGA-3’；③5’-TACTT CATGA AGATC ATGAA GGATG TGTGG TGTAT-3’。針對大鼠P65靶基因的mRNA 序列為：①5’-AGCGG GGCAT GCGTT TCCGT TACAA GTGCG AGGGC-3’；②5’-GCCAG ACACA GACGA TCGCC ACCGG ATTGA AGAAA-3’；③5’-ATGCT GATGG AGTAC CCTGA AGCTA TAACT CGCCT-3’。

表1 組織學損傷評分標準

具體步驟：①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；②按30% H2O2:10份=1:10（體積比）混合，室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；③暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1 mL3%檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化20 min；④后固定：固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1 000 DEPC。室溫固定10 min。⑤預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度，按每張切片滴加20 μL預雜交液，恒溫箱42℃ 4 h；⑥雜交：按每張切片20 μL雜交液（內(nèi)含多聚寡核苷酸探針MIP3-α，2 μg·mL-1），加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜。⑦雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC 洗滌5 min×2 次；⑧滴加封閉液：37℃30 min。⑨滴加生物素化鼠抗地高辛（試劑盒內(nèi)帶即用型）：37℃60 min。⑩滴加SABC-HRP（試劑盒內(nèi)帶即用型）：室溫30 min。11、滴加生物素化過氧化物酶（試劑盒內(nèi)帶即用型），增加檢測的敏感性：室溫30 min。12、DAB 顯色：使用DAB 顯色試劑盒—1mL 蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本上，顯色20 min。13、蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。此部分試劑盒根據(jù)實驗檢測指標在博士得試劑公司定制。

1.6.3 大鼠結(jié)腸CCL20、CCR6、NF-κB P65免疫熒光檢測

①檸檬酸鹽緩沖液微波98℃抗原修復:；②一抗羊抗大鼠CCL20、CCR6、NF-κB P65（美國Santa cruz公司）37℃溫孵2 h；③兔抗羊IgG-FITC 1:100（美國Santa cruz公司）室溫溫孵2h；④封片增強劑（美國Sigma公司）封片；⑤每張標本隨機采集3個視野，BX53熒光顯微鏡（日本Olympus公司）圖像采集，對每個標本的3個視野的熒光強度取均值后納入統(tǒng)計分析，采用Image Pro Plus分析熒光灰度。

1.6.4 ELISA法檢測大鼠結(jié)腸黏膜IL-23

新鮮結(jié)腸黏膜組織勻漿離心后取上清液，加入100 μL標準品、100 μL已適當稀釋標本于相應板孔中；加入100 μL兔抗鼠IL-23；溫育20 min后洗板，加入100 μL 1x HRP，洗板后每孔加入100 μL TMB顯色液，輕輕混勻10s，每孔加入100 μL終止液。輕輕混勻30 s，15 min內(nèi)臟450 nm處讀OD值。IL-23（ng·mL-1）=標準曲線上查出的濃度×標本的稀釋倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。對數(shù)據(jù)作正態(tài)分布檢驗。數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），取檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果

2.1 健脾方對CD大鼠一般情況的影響

第4周干預結(jié)束后，觀察各組大鼠的一般情況，可見正常組大鼠活動自如、精神振奮、飲食自如、大便正常、毛色有光澤；CD模型組大鼠精神欠佳、飲食減少、活動及反應能力下降、皮毛稀疏、大便次數(shù)增多、肛門紅腫明顯、肛門處有稀便附著、偶有便血、質(zhì)稀不成形，符合中醫(yī)中濕邪困脾納呆、重濁黏膩的特征。經(jīng)健脾方治療后的大鼠一般狀態(tài)已較CD模型組好轉(zhuǎn)、精神尚可、飲食增加、大便時可見成形但較軟、健脾方發(fā)揮了健脾化濕、解毒涼血的功效。

2.2 CD大鼠結(jié)腸組織學損傷評分及HE染色

正常組大鼠結(jié)腸組織肉眼觀察結(jié)腸腸管粗細均勻，結(jié)腸壁厚薄一致，柔軟有彈性，腸黏膜面光滑整齊，黏膜皺襞完整，無出血點、糜爛及潰瘍。HE染色鏡下顯示，結(jié)腸黏膜上皮無缺損，腺體排列整齊，黏膜及黏膜下層無充血、水腫、炎細胞浸潤等異常改變，結(jié)構(gòu)完好。見圖1（A）。

CD模型組大鼠肉眼觀察腸管局部狹窄，腸壁厚薄不均，局部增厚變硬，結(jié)腸黏膜充血水腫，血管紋理模糊，廣泛分布的糜爛及潰瘍，潰瘍大小、形狀和深度不一，多數(shù)為小塊狀甚至連接成片，多累及黏膜、黏膜下層，深達肌層。HE染色鏡下顯示結(jié)腸黏膜上皮細胞壞死、脫落，腸壁全層大量炎癥細胞浸潤，肉芽腫形成，纖維組織增生。見圖1（B）。

與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)評分、結(jié)腸組織學損傷評分均明顯增加（P＜0.05）。這說明CD模型大鼠制備成功，其病理表現(xiàn)與前期報道一致[13-16]。健脾方治療后，肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜表面欠光滑，可見少許黏液，少量散在糜爛，其周圍黏膜組織充血水腫。HE染色鏡下顯示結(jié)腸黏膜腺體排列紊亂，黏膜下有水腫。見圖1（C）。

與模型組相比，健脾方組大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)評分、結(jié)腸組織學損傷評分均顯著降低（P＜0.05）。這說明健脾方可有效改善CD大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，減輕結(jié)腸組織損傷，具有良好的修復CD受損結(jié)腸組織的作用。各組大鼠結(jié)腸HE染色及組織學損傷評分如下，評分標準詳見表1[17，18]。見圖1（D）。

2.3 健脾方對CD大鼠結(jié)腸CCL20、CCR6、NF-κB P65 mRNA表達的影響

通過原位雜交方法檢測大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)中CCL20 mRNA的表達情況見圖2 （A-D）。研究結(jié)果顯示：與正常大鼠圖2（A）相比，CD模型大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)CCL20 mRNA表達明顯增強（P＜0.05）。健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸CCL20 mRNA表達的積分光密度值（P＜0.05），見圖2（C），圖像分析結(jié)果見圖2（D）。

采用同樣的方法檢測CCL20受體CCR6的表達情況，見圖2（E-H）。與正常組圖2（E）相比，模型組大鼠結(jié)腸CCR6 mRNA陽性的積分光密度也明顯增強（P＜0.05），見圖2（F），健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸CCR6 mRNA陽性積分光密度值（P＜0.05），見圖2（G）。

同時，筆者也觀察了TNBS誘導的炎癥過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的mRNA的表達見圖2（I-L），與正常組圖2（I）相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)，NF-κB P65 mRNA陽性表達明顯增強（P＜0.05），見圖2（J），健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸NF-κB P65 mRNA陽性積分光密度值（P＜0.05），少量表達于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)，見圖2（K）。提示健脾方能夠下調(diào)CD大鼠結(jié)腸異常增高的NF-κB P65 mRNA表達，圖像分析結(jié)果見圖2（L）。

2.4 健脾方對CD大鼠結(jié)腸CCL20、CCR6、NF-kappaB P65蛋白表達的影響

免疫熒光技術(shù)檢測大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)CCL20蛋白的表達情況（圖3 A-D），研究結(jié)果顯示：與正常大鼠（圖3-A）相比，CD模型大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)CCL20表達明顯增強（P＜0.05）（圖3-B），健脾方能夠明顯下調(diào)大鼠結(jié)腸黏膜CCL20的表達（P＜0.05）（圖3-C），圖像分析結(jié)果見圖3-D。通過對CCL20受體蛋白CCR6表達情況檢測發(fā)現(xiàn)（圖3 E-H），與正常組（圖3-E）相比，模型組大鼠結(jié)腸CCR6 蛋白陽性表達增強（P＜0.05）（圖3-F），健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸CCR6 陽性積分光密度值（P＜0.05）（圖3-G）。在對TNBS誘導的CD炎癥過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65檢測發(fā)現(xiàn)（圖3I-L），與正常組（圖3-I）相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)NF-κB P65陽性表達明顯增強（P＜0.05）（圖3-J），健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)NF-κB P65陽性積分光密度值（P＜0.05），（圖3-K）。提示健脾方能夠下調(diào)CD大鼠結(jié)腸異常增高的NF-κB P65表達，圖像分析結(jié)果見圖3-L。熒光檢測結(jié)果同原位雜交檢測結(jié)果一致。

圖1 CD大鼠結(jié)腸組織學損傷評分及HE染色（×200）

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜中CCL20、CCR6、NF-κB P65 mRNA表達情況（×200）

圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜中CCL20、CCR6、NF-κB P65表達情況（×200）

2.5 健脾方對CD大鼠結(jié)腸粘膜IL-23的影響

由圖5可知，ELISA結(jié)果顯示IL-23在正常組大鼠結(jié)腸黏膜中呈低表達，在模型組中呈高表達狀態(tài)（P＜0.05）。健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸細胞因子IL-23的表達水平（P＜0.05）。

3 討論

中醫(yī)學沒有關(guān)于克羅恩病的專門論述，目前多數(shù)學者認為其屬于中醫(yī)學“腹痛”、“泄瀉”、“腸澼”、“交腸”等范疇，如《內(nèi)經(jīng)》描述的“腸澼”、“赤沃”、“注下赤白”與CD癥狀接近。濕熱蘊結(jié)、脾胃虛弱是克羅恩病的主要病因病機，清熱健脾是中醫(yī)藥治療克羅恩病的有效治療原則，考慮此病反復發(fā)作、持續(xù)時間較長，久病及腎，故以茯苓、白術(shù)、補骨脂健脾化濕溫腎。健脾方由補骨脂、茯苓、白術(shù)、白頭翁、馬齒莧、石榴皮、炙訶子、藿香組成。方中補骨脂溫脾止瀉、補腎助陽，茯苓利水滲濕、健脾寧心，白術(shù)健脾燥濕，利水化濕，白頭翁清熱解毒，涼血止痢，馬齒莧清熱解毒，止血涼血，石榴皮澀腸止瀉、止血，炙訶子澀腸止瀉，藿香辟穢祛濕，構(gòu)成本方健脾化濕、溫腎澀腸、解毒涼血之功效，本研究通過觀察CD模型大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷及組織病理學評分，結(jié)合結(jié)腸粘膜細胞因子IL-23、CCL20及其受體CCR6、以及NF-ΚB p65表達，研究健脾方治療CD的可能的效應與作用機制。

在正常結(jié)腸黏膜組織中，趨化因子CCL20和CCR6僅有少量表達，呈弱陽性。CCL20與CD4+T細胞表面CCR6結(jié)合后，可趨化和激活各種白細胞、未成熟樹突狀細胞和淋巴細胞和T細胞亞群等[19]，促使樹突狀細胞從血液遷移至消化道黏膜固有層[20-23]。臨床研究表明，CD患者CCL20 mRNA含量遠遠高于UC患者[24]。而且炎癥性腸病基因組研究表明CCR6基因多態(tài)性與CD相關(guān)[25-27]。在CD結(jié)腸上皮細胞均分泌CCL20，且可被IL-1β和TNFα誘導，CCR6+未成熟樹突狀細胞被募集至黏膜固有層[28，29]，且黏膜炎癥可以在阻斷CCL20和CCR6信號途徑后減輕。給藥中和CCL20抗體，可抑制CCR6+T細胞募集至黏膜固有層，減輕結(jié)腸炎癥[30]。TNBS誘導的CD大鼠經(jīng)健脾方治療，通過結(jié)腸組織學損傷評分及HE染色觀察其療效顯著，CD是一種與機體免疫功能異常密切相關(guān)的疾病，有研究顯示：阻斷CCL20和CCR6信號途徑后，可減輕黏膜炎癥[30]。本實驗發(fā)現(xiàn)CCL20和CCR6 mRNA在大鼠結(jié)腸黏膜中呈現(xiàn)少量表達狀態(tài)，TNBS能夠誘導炎癥的出現(xiàn)，同時CCL20、CCR6 mRNA出現(xiàn)表達的上調(diào)，與前期研究結(jié)果一致[28，29]，IL-23在正常組大鼠結(jié)腸黏膜中呈低表達，在模型組中呈高表達狀態(tài)。健脾方可顯著降低大鼠結(jié)腸細胞因子IL-23的表達水平。在對CCL20、CCR6蛋白表達的觀察中發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白會同基因呈現(xiàn)出同樣的變化趨勢，筆者可以推論，健脾方能夠下調(diào)CD大鼠結(jié)腸IL-23、CCL20、CCR6相關(guān)的炎癥，改善CD大鼠一般情況，發(fā)揮良好的治療作用。

NF-κB p65作為參與炎癥反應的基因調(diào)控中的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與了CD的發(fā)生與發(fā)展，NF-κB最常見的為p65/p50異二聚體，也是其活性的主要形式[31]。有研究表明，CCL20是NF-κB的靶基因，且NF-κB可進一步增強IL-23、CCL20以及CCR6的表達[4]。不同疾病研究中顯示：免疫和炎癥反應中大量基因的表達受NF-κB的調(diào)節(jié)?？稍谡{(diào)控免疫應答、炎癥反應、細胞增殖、分化和細胞凋亡等不同的生理病理過程中與所必需的多種基因啟動子或增強子上的位點特異結(jié)合，啟動這些基因的轉(zhuǎn)錄，可見其在機體的免疫應答、炎癥反應和細胞的生長發(fā)育中起重要作用[32，33]。有研究顯示CD患者的NF-κB p65表達很高，尤其是大量表達在CD的活動期NF-κB，主要存在于上皮細胞與巨噬細胞[34]。在筆者的動物研究發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB P65及其mRNA會隨著TNBS誘導炎癥的出現(xiàn)而表達增加，參與CD的發(fā)生與發(fā)展。健脾方同樣能夠發(fā)揮下調(diào)CD大鼠結(jié)腸異常增高的NF-κB p65及其 mRNA表達的作用。

圖4 各組大鼠結(jié)腸黏膜中IL-23表達情況

綜上所述，健脾方可減輕CD大鼠結(jié)腸黏膜炎癥，具有良好的治療作用。下調(diào)CD大鼠結(jié)腸異常增高的NF-κB P65表達，同時能夠降低CD大鼠結(jié)腸異常增高的IL-23、CCL20及其受體CCR6的表達，筆者初步推測，這可能是健脾方治療CD大鼠潛在的重要機制。趨細胞因子IL-23、CCL20與其受體CCR6、NF-κB與腸道炎癥和免疫應答中密切相關(guān)，降低CD大鼠結(jié)腸異常增高的IL-23、CCL20及其受體CCR6的表達可能是其治療克羅恩病的重要靶點。但針對IL-23、CCL20/CCR6與NF-κB p65相關(guān)性分析有待于進一步深入研究，同時，健脾方的藥理作用可能涉及到多靶點、多途徑來發(fā)揮其效應機制，本研究初步揭示健脾方治療CD的效應機制，以期為中醫(yī)藥治療CD提供了新的選擇和選擇依據(jù)。

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Study on Regulation Mechanism of NF-κB P65, IL-23, CCL20 and Its Receptors in Colon of Rat Model of Crohn’s Disease Treated by Spleen-invigorating Prescription

Wu Luyi1, Liu Huirong2, Weng Zhijun2, Lu Ying1, Ji Guang3
(1. Shanghai Research Institute of Qigong, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China; 2. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China; 3. Shanghai Research Institute of Spleen and Stomach Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China)

This study was aimed to observe the effect of nuclear factor NF-κB P65 signaling pathway on cytokine IL-23, chemokine macrophage inflammatory protein-3 (CCL20) and its receptor CCR6 expression, and related mechanisms of spleen-invigorating prescription in the prevention and treatment of Crohn’s disease (CD) induced by trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). A total of 24 male SD rats were randomly divided into: (1) normal control group (NG,n= 8): rats in this group were given distilled water from the second week, once a day, the amount of gastric lavage according to 0.1 mL·kg-1, a total of 3 weeks; (2) model of TNBS group (MG,n= 8): rats in this group were given TNBS enema from the first week, enema dose (mL) = body weight (g) × 0.003 ml·g-1, once a week, the molding lasted a total of 4 weeks; (3) model of TNBS and spleen-invigorating prescription treatment group (JP,n= 8): rats in this group were treated with traditional Chinese medicine (TCM) of spleen-invigorating prescription in the second day from the beginning of the second week after TNBS enema, the amount of gastric lavage treatment according to 0.1 mL·kg-1, once a day by gavage for 3 weeks. The curative effect of the method of the colon tissue damage and the pathology of HE were used to observe the curative effect of the spleen-invigorating prescription. Immunofluorescence, ELISA and in situ hybridization were used to observe the expression of NF-κB P65, IL-23, CCL20, CCR6 protein and gene in colon mucosa of rats in each group. The results of immunofluorescence andin situ hybridization showed that CCL20 and CCR6 in the normal group rat’s colon were less expressed, while in the model group showed high expression (P＜0.05). Spleen-invigorating prescription can significantly reduce the expression of CCL20 and its receptor CCR6 in rat’s colon (P＜0.05). NF-κB P65 in normal rat’s colon showed low expression, while in the model group showed high expression (P＜0.05). And spleen-invigorating prescription can significantly reduce rat’s colon NF-κB P65 expression level (P＜0.05). ELISA results showed that the expression of IL-23 was low in the colon of rats in the normal group, while in the model group showed high expression (P＜0.05). Spleen-invigorating prescription can significantly reduce the rat colonic cytokine IL-23 expression levels (P＜0.05). It was concluded that spleen-invigorating prescription can reduce the degree of colitis in CD rats induced by TNBS. Its underlying mechanism was related to the inhibition of the NF-κB P65 signaling pathway, and then affect the expression of IL-23 and CCL20/CCR6.

Crohn’s Disease, NF-κB P65, IL-23, CCL20, Spleen-invigorating Prescription

10.11842/wst.2016.03.014

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2015-03-04

＊ 上海市教委優(yōu)秀青年教師科研基金（zzszy12011）：克羅恩病模型制備及清熱健脾方調(diào)節(jié)作用研究，負責人：吳璐一；上海中醫(yī)藥大學上海市針灸推拿學重點學科科研項目（JZ2012019）：灸藥結(jié)合治療克羅恩病的研究，負責人：吳璐一。

＊＊ 通訊作者：季光，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治酒精肝和脂肪肝的基礎(chǔ)與臨床研究。