基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法

崔 晗,王 允*,邱麗榮,趙維謙,朱 恪

1. 北京理工大學(xué)、精密光電測(cè)試儀器及技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京 100081 2. 中國科學(xué)院物理研究所、北京 100190

基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法

崔 晗1,王 允1*,邱麗榮1,趙維謙1,朱 恪2

1. 北京理工大學(xué)、精密光電測(cè)試儀器及技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京 100081 2. 中國科學(xué)院物理研究所、北京 100190

拉曼光譜技術(shù)因其光譜信息豐富、非接觸、無破壞、樣品用量少、高靈敏度等特點(diǎn)、為現(xiàn)代前沿基礎(chǔ)科研領(lǐng)域提供一種有力的分析手段、成為分析科學(xué)的研究熱點(diǎn)。激光共焦拉曼技術(shù)結(jié)合共焦顯微探測(cè)和拉曼光譜探測(cè)技術(shù)、具有空間分辨力高、可層析探測(cè)的優(yōu)勢(shì)、在物理化學(xué)、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、考古及文物鑒定、刑偵科學(xué)等眾多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)有共焦拉曼系統(tǒng)由于在掃描過程中無法對(duì)探測(cè)點(diǎn)進(jìn)行定焦、因而在長時(shí)間的探測(cè)過程中會(huì)因環(huán)境變化、系統(tǒng)漂移等問題導(dǎo)致系統(tǒng)離焦、從而造成測(cè)量結(jié)果存在誤差甚至錯(cuò)誤的問題。本文針對(duì)這一問題、在現(xiàn)有共焦拉曼系統(tǒng)的基礎(chǔ)上、提出一種基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法。該方法利用二次曲線對(duì)光譜共焦曲線進(jìn)行擬合、通過尋找曲線最大值、得到系統(tǒng)焦點(diǎn)、進(jìn)而在掃描過程中對(duì)每個(gè)探測(cè)點(diǎn)進(jìn)行焦點(diǎn)定位后、采集該點(diǎn)光譜信息、從而保證掃描過程中系統(tǒng)始終位于焦點(diǎn)位置、消除系統(tǒng)離焦對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響、實(shí)現(xiàn)共焦拉曼光譜系統(tǒng)的精確測(cè)量。通過仿真分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本文提出的基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法可以有效消除系統(tǒng)離焦對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響、提高系統(tǒng)軸向定焦的準(zhǔn)確度、為共焦拉曼光譜技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供了保證、是一種行之有效的定焦準(zhǔn)確、抗漂移強(qiáng)的拉曼光譜測(cè)量方法。

共焦拉曼； 二次曲線擬合； 高準(zhǔn)確度； 抗漂移

引 言

自1990年P(guān)uppels等將共焦顯微技術(shù)與拉曼光譜探測(cè)技術(shù)相結(jié)合發(fā)明共焦拉曼光譜技術(shù)、并成功用于探測(cè)單細(xì)胞和染色體的形態(tài)與組成起[1]、激光共焦拉曼技術(shù)因繼承了拉曼光譜技術(shù)獨(dú)特的“分子指紋”特性和共焦技術(shù)的高分辨層析成像特性、而被作為極其重要的光譜探測(cè)手段廣泛應(yīng)用于物理學(xué)[2-3]、材料科學(xué)[4-5]、醫(yī)學(xué)[6-7]、生物學(xué)[8]、地質(zhì)學(xué)[9-10]、考古及文物鑒定[11]、刑偵科學(xué)[12]等領(lǐng)域。

在物理化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域、分析樣品的化學(xué)成分、空間分布、表面物理化學(xué)性質(zhì)時(shí)、常以圖像的形式來獲取樣品更多的信息、因此需要將拉曼光譜探測(cè)由單點(diǎn)分析的方式拓展到對(duì)一定區(qū)域范圍內(nèi)樣品的探測(cè)分析、即拉曼光譜成像。然而、在拉曼光譜成像時(shí)需要較長的探測(cè)時(shí)間、常達(dá)幾個(gè)小時(shí)、甚至是幾十小時(shí)[8]、才能完成。而在長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)過程中、例如活體探測(cè)、由于生物的運(yùn)動(dòng)、致使系統(tǒng)離焦[13]、導(dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)果； 另外、儀器在長時(shí)間成像過程中受環(huán)境溫度、振動(dòng)、空氣抖動(dòng)等影響較大、同樣易使系統(tǒng)產(chǎn)生漂移、從而導(dǎo)致樣品被探測(cè)位置產(chǎn)生離焦?？梢?、在采集光譜信息的過程中、對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定焦是非常必要的。由于現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測(cè)技術(shù)不具備實(shí)時(shí)焦點(diǎn)跟蹤能力、因而在整個(gè)成像過程中、無法補(bǔ)償因樣品探測(cè)位置偏移引入的離焦誤差、制約了共焦拉曼光譜成像技術(shù)的應(yīng)用。為此、本文基于二次曲線對(duì)光譜共焦曲線進(jìn)行擬合、尋找曲線極值點(diǎn)、對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行精確定焦、改善系統(tǒng)定焦準(zhǔn)確性、消除系統(tǒng)離焦對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1 共焦拉曼光譜技術(shù)基本原理

共焦成像原理是一種點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的成像技術(shù)、其將點(diǎn)光源、樣品被測(cè)點(diǎn)和共焦針孔置于彼此對(duì)應(yīng)的共軛位置上、利用逐點(diǎn)照明和空間針孔調(diào)制來去除樣品非焦點(diǎn)平面散射光、與傳統(tǒng)成像方法相比可以提高光學(xué)分辨力。

共焦拉曼系統(tǒng)原理如圖1所示、激光經(jīng)準(zhǔn)直擴(kuò)束并被Notch Filter反射后、經(jīng)物鏡在物體表面聚焦成光斑、激發(fā)出載有樣品信息的拉曼散射光、拉曼散射光沿原光路返回、再透射過Notch Filter將拉曼散射光導(dǎo)入放置于單色儀前面的共焦針孔內(nèi)、形成點(diǎn)檢測(cè)、單色儀只接收來自物鏡焦點(diǎn)處的拉曼散射光、焦點(diǎn)以外的光全被針孔屏蔽。當(dāng)物體恰好位于焦平面時(shí)、單色儀接收到的拉曼散射光能量最大； 當(dāng)物體偏離焦平面時(shí)、拉曼散射光被聚焦于像焦平面前或后的某個(gè)位置上、此時(shí)單色儀僅接收到部分光譜能量、因此、樣品離焦時(shí)容易造成探測(cè)信號(hào)降低、進(jìn)而造成掃描成像結(jié)果錯(cuò)誤。

圖1 共焦拉曼原理圖

因此、根據(jù)共焦拉曼成像原理、為獲得足夠強(qiáng)度的拉曼光譜信號(hào)、測(cè)量時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定焦、而現(xiàn)有共焦拉曼光譜系統(tǒng)依靠圖像清晰度進(jìn)行定焦、同時(shí)無法進(jìn)行焦點(diǎn)跟蹤、不能補(bǔ)償實(shí)際測(cè)量中因樣品離焦而造成的影響。

從圖1中可以看出、共焦拉曼光譜軸向曲線呈鐘形分布、峰值點(diǎn)準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)物鏡焦點(diǎn)、但是實(shí)際測(cè)量中、受采樣間隔限制、測(cè)量數(shù)據(jù)呈離散化分布、難以精度捕獲峰值點(diǎn)、并且受系統(tǒng)噪聲影響、峰值點(diǎn)附近數(shù)據(jù)可能發(fā)生無規(guī)律跳躍、如圖2所示、導(dǎo)致峰值點(diǎn)位置由點(diǎn)H偏移到點(diǎn)M、造成焦點(diǎn)定位錯(cuò)誤、進(jìn)而影響共焦拉曼系統(tǒng)的成像質(zhì)量、因此、針對(duì)該問題本文提出基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法。

圖2 共焦拉曼曲線最大值對(duì)比圖

2 算法原理

2.1 基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)原理

為解決系統(tǒng)離焦及定焦不準(zhǔn)確對(duì)測(cè)量結(jié)果造成的影響、我們擬利用基于曲線擬合的共焦拉曼光譜測(cè)量方法進(jìn)行改善。本文利用現(xiàn)有共焦拉曼技術(shù)中的光譜軸向響應(yīng)曲線、采用對(duì)每個(gè)探測(cè)點(diǎn)進(jìn)行定焦的方法消除共焦拉曼光譜系統(tǒng)因離焦對(duì)結(jié)果造成的影響、采用曲線擬合尋找共焦曲線峰值點(diǎn)的方法確定共焦拉曼系統(tǒng)焦點(diǎn)、消除共焦拉曼系統(tǒng)因隨機(jī)誤差對(duì)測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。

圖3 共焦擬合算法原理

共焦擬合算法基于二次曲線擬合、利用共焦曲線最大值兩側(cè)邊附近區(qū)間內(nèi)的數(shù)據(jù)、擬合二次曲線方程、通過尋找二次曲線方程的峰值點(diǎn)確定共焦曲線極值點(diǎn)位置、進(jìn)而確定系統(tǒng)焦點(diǎn)位置。從共焦系統(tǒng)的軸向響應(yīng)特性曲線可以看出、其理論特性曲線關(guān)于極值點(diǎn)位置左右對(duì)稱、并且在極值附近的數(shù)據(jù)具有二次曲線特性。因而、如圖3共焦擬合算法原理所示、該方法利用共焦曲線靠近極值點(diǎn)附近的數(shù)據(jù)來進(jìn)行擬合、而由該數(shù)據(jù)段擬合得出的共焦特性曲線極值點(diǎn)位置的準(zhǔn)確度也得到大幅提高。

本文利用二次曲線對(duì)光譜共焦曲線進(jìn)行擬合、并采用最小二乘法進(jìn)行回歸方程求解、最小二乘法具有擬合數(shù)據(jù)與真實(shí)數(shù)據(jù)之間殘差和最小的特點(diǎn)、使得擬合方程更能準(zhǔn)確的反應(yīng)真實(shí)數(shù)據(jù)的分布。

基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測(cè)方法需要在顯微物鏡上安裝物鏡驅(qū)動(dòng)器(piezoelectric ceramic acutator,PZT)以帶動(dòng)物鏡進(jìn)行軸向掃描、利用該方法進(jìn)行拉曼光譜測(cè)量、具體可分為以下五步：

Step1：通過計(jì)算機(jī)軟件設(shè)置掃描層數(shù)N、通過確定掃描上下限、及掃描層間隔、得到相應(yīng)的掃描層數(shù)N；

Step2：通過PZT控制物鏡移動(dòng)、快速探測(cè)每層位置的拉曼光譜；

Step3：提取每層光譜光強(qiáng)最大值Imi、獲得光譜共焦曲線I；

Step4：基于二次曲線、對(duì)光譜共焦曲線I進(jìn)行擬合、并獲得系統(tǒng)焦點(diǎn)位置；

Step5：利用PZT驅(qū)動(dòng)物鏡移動(dòng)到Step4中獲得的焦點(diǎn)位置、并探測(cè)焦點(diǎn)位置拉曼光譜。

圖4為基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測(cè)方法的焦點(diǎn)定位流程圖。

圖4 焦點(diǎn)定位流程圖

2.2 仿真分析

如圖3共焦曲線擬合原理所示、對(duì)共焦曲線進(jìn)行二次曲線擬合時(shí)、擬合數(shù)據(jù)段區(qū)間的選取需要兼顧擬合優(yōu)度、隨著擬合區(qū)間的擴(kuò)大、擬合優(yōu)度降低、因此、需要根據(jù)實(shí)際測(cè)量曲線和數(shù)據(jù)量進(jìn)行優(yōu)化選擇。本文以共焦拉曼理論軸向響應(yīng)曲線為對(duì)象、采用連續(xù)曲線離散化數(shù)據(jù)作為擬合輸入數(shù)組、根據(jù)最小二乘擬合算法、以殘差為依據(jù)對(duì)共焦拉曼系統(tǒng)軸向定焦響應(yīng)曲線的擬合區(qū)間進(jìn)行仿真分析與優(yōu)化選取。

本文以共焦曲線最大值附近、以附加1%高斯噪聲的曲線的最大值60%～95%范圍為備選區(qū)間、針對(duì)于不同的區(qū)間、對(duì)其進(jìn)行仿真分析、根據(jù)菲涅爾衍射理論、構(gòu)建共焦拉曼探測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)量理論模型、對(duì)系統(tǒng)的軸向定焦響應(yīng)進(jìn)行仿真計(jì)算、得到共焦拉曼探測(cè)系統(tǒng)的理論軸向響應(yīng)函數(shù)、并通過光學(xué)反向歸一化公式獲得系統(tǒng)擬合的目標(biāo)函數(shù)、以最小二乘法建立遞歸方程判別殘差梯度方向、迭代計(jì)算得到最佳擬合曲線、并進(jìn)行峰值點(diǎn)遍歷定位。

為獲得最優(yōu)化的擬合結(jié)果、本文針對(duì)數(shù)據(jù)擬合曲線的選取進(jìn)行仿真分析、對(duì)擬合優(yōu)度和擬合區(qū)間進(jìn)行了優(yōu)化選擇。從表1中可以看出、擬合區(qū)間越接近極值附近、其殘差越小、二次曲線特性越好。在所給范圍內(nèi)、擬合區(qū)間為最大值95%時(shí)、該段數(shù)據(jù)的殘差最小、二次曲線特性最好、但是該區(qū)間范圍較小、擬合數(shù)據(jù)過少、因此、為兼顧擬合區(qū)間與擬合優(yōu)度、選取區(qū)間82.5%為擬合區(qū)間。為使擬合數(shù)據(jù)充足、在82.5%區(qū)間附近2.5%范圍內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大選取、發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)段內(nèi)、保證殘差不變時(shí)的最大擬合區(qū)間為最大值的81.5%處。因而、本文在均衡殘差與擬合區(qū)間范圍后、選取最大值81.5%以上的數(shù)據(jù)為曲線擬合時(shí)的擬合數(shù)據(jù)。

表1 擬合區(qū)間與殘差值

基于以上仿真分析、對(duì)光譜強(qiáng)度共焦曲線進(jìn)行二次曲線擬合求解系統(tǒng)焦點(diǎn)位置的具體步驟如下。

Step1: 選取光譜強(qiáng)度共焦曲線強(qiáng)度最大值81.5%以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)為二次曲線擬合區(qū)間；

Step2: 對(duì)選取的數(shù)據(jù)段利用二次曲線方程進(jìn)行擬合、得到二次曲線擬合方程IQ(z)；

Step4: 被測(cè)點(diǎn)的焦點(diǎn)O位置即為z=z0處。

3 結(jié)果與討論

采用單晶硅為實(shí)驗(yàn)樣品、進(jìn)行以下幾組實(shí)驗(yàn)測(cè)試?，F(xiàn)有共焦拉曼光譜技術(shù)與基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術(shù)受系統(tǒng)離焦影響的大?。簩悠贩謩e置于物鏡焦點(diǎn)位置、離焦0.1～5 μm 范圍內(nèi)(其中、0.1～1 μm離焦范圍內(nèi)離焦采集間隔為0.1、2～5 μm離焦范圍內(nèi)離焦采集間隔1 μm)、并分別采用現(xiàn)有共焦拉曼光譜技術(shù)和基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測(cè)方法進(jìn)行拉曼光譜探測(cè)、觀察光譜信號(hào)強(qiáng)度變化。其中、激發(fā)光源為532nm、激光器穩(wěn)定性為±2%(8hrs ±1.5 ℃)、顯微物鏡放大倍率為100倍、數(shù)值孔徑為0.9、光譜CCD暗噪聲為0.000 6e-/s/pixel。圖5和圖6所示為兩種方法在拉曼頻移為520.7 cm-1時(shí)、光譜強(qiáng)度信號(hào)變化。

圖5為采用現(xiàn)有共焦拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行光譜強(qiáng)度變化測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、從圖5中可以看出、當(dāng)系統(tǒng)離焦0～1 μm時(shí)、光譜強(qiáng)度由100%減弱到56%； 當(dāng)系統(tǒng)離焦1～2 μm時(shí)、光譜強(qiáng)度衰減到27%、光強(qiáng)衰減速率減小； 當(dāng)系統(tǒng)離焦3～5 μm時(shí)、光譜強(qiáng)度由15%衰減到6%、光譜強(qiáng)度趨于平緩； 在系統(tǒng)離焦5 μm時(shí)、光譜強(qiáng)度僅為焦點(diǎn)位置光譜強(qiáng)度的6%、衰減明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用現(xiàn)有共焦拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行光譜測(cè)量時(shí)、受系統(tǒng)離焦影響嚴(yán)重、光譜光強(qiáng)衰減較大。

圖5 共焦拉曼光譜技術(shù)離焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術(shù)離焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6為采用基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行光譜強(qiáng)度變化測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、從圖6中可以看出、由于采用二次曲線擬合的方法精確尋找焦點(diǎn)位置、對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定焦、保證系統(tǒng)始終位于焦點(diǎn)位置、因而、在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的5μm離焦范圍內(nèi)、光譜強(qiáng)度變化可以忽略、幾乎保持不變。

從圖5所示的結(jié)果中可以看出、現(xiàn)有共焦拉曼技術(shù)在沒有實(shí)時(shí)定焦的情況下、隨著系統(tǒng)離焦量的增大、光譜強(qiáng)度衰減逐漸減弱、最終趨于平緩。但是、在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)測(cè)試中、受系統(tǒng)漂移、環(huán)境變化等影響、產(chǎn)生1 μm以內(nèi)的系統(tǒng)離焦非常常見、而從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出、1 μm離焦量范圍內(nèi)、光譜光強(qiáng)變化非常劇烈、從而嚴(yán)重影響了實(shí)際測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。從圖6所示的結(jié)果中可以看出、本文提出的基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法、保證了系統(tǒng)始終位于焦點(diǎn)位置、在5 μm離焦范圍內(nèi)光譜光強(qiáng)幾乎保持不變、因而、可以有效改善系統(tǒng)離焦對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響、同時(shí)利用光譜強(qiáng)度共焦曲線進(jìn)行二次擬合、提高了焦點(diǎn)定位的準(zhǔn)確度。

4 結(jié) 論

基于現(xiàn)有共焦拉曼技術(shù)、結(jié)合實(shí)際需求、提出了一種基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法、該方法對(duì)每個(gè)探測(cè)點(diǎn)進(jìn)行定焦探測(cè)、消除了系統(tǒng)離焦對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響、同時(shí)、利用二次曲線對(duì)光譜共焦曲線進(jìn)行二次擬合提高了共焦拉曼系統(tǒng)定焦準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有定焦準(zhǔn)確、抗漂移明顯的效果、隨著拉曼光譜應(yīng)用需求的深入、對(duì)系統(tǒng)性能的要求也不斷增加、基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測(cè)方法將在生物、材料等領(lǐng)域形成廣泛應(yīng)用。

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(Received Dec. 4,2015; accepted Apr. 22,2016)

*Corresponding author

Aug. 27,2015; accepted Dec. 11,2015)

Confocal Raman Spectroscopy Method Based on Quadratic Curve Fitting

CUI Han1,WANG Yun1*,QIU Li-rong1,ZHAO Wei-qian1,ZHU Ke2

1. Beijing Key Lab for Precision Optoelectronic Measurement Instrument and Technology,School of Optoelectronics,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China 2. Institute of Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China

Raman spectroscopy plays an improtant role in analytical science because of its unique characteristics,such as non-contact and non-destructive detecting,fewer sample consumption,high sensitivity and other characteristics,and it provides a powerful analytical tool for the modern basic research fields. Because of the combination of confocal microscopy technology and Raman spectroscopy technology,confocal Raman microscopy has the advantage of both high resolution spectroscopy and chromatography detection,which inherits from confocal microscopy and raman spectroscopy. As a result,it is widely used in many fields,such as physical chemistry,materials science,biomedical,archaeological,cultural identification,and forensic science. But with the environmental changing,the system drifting or other issues,during the long detection process,the system turns to defocusing. As a result,during the hole scanning process,the system can not be focused on every detection point,and then it would lead to a mistake. Eventurally,conventional confocal Raman system could obtain the presence of measurement error even erroneous results in the long process. In this paper,on the basis of conventional confocal Raman system,a confocal Raman spectroscopy method based on quadratic curve fitting is proposed to solve this problem. Based on the principle that the maxium of the concal curve corresponding the system foucs,the steps to find system foucus as follows: fist,usesing quadratic curve to fit confocal curve; second,finding the maxium of the confocal curve; and last obtaining the system foucs. With this method,during the scanning process,every point should be focused,therefore,the effect of defocusing is eliminated efficiently,and accurate measurements of confocal Raman spectroscopy system is achieved.Through simulation and experimental results show that: the proposed method that confocal Raman spectroscopy method based on quadratic curve fitting can effectively eliminate the influence of system defocus on experimental result,and effectively improve the axial system of fixed focus accuracy,which could provide a guarantee for further application of confocal Raman spectroscopy. This anti-drift method is effective and accurate in focusing with great potential to be applied in broader areas.

Confocal Raman; Quadratic curve fit; High accuracy; Anti-drift

2015-12-04、

2016-04-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61475020),國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)基金項(xiàng)目(51535002)和國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(NIP)課題項(xiàng)目(2011YQ04013601,2011YQ04013607)資助

崔 晗、1990年生、北京理工大學(xué)光電學(xué)院博士研究生 e-mail: cuih1990@gmail.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: alotrabbits@163.com

O433.1

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3958-05