5-HT1B受體亞型對小腦頂核介導的運動行為的影響*

高偉，王楠，喬虎

趙明1△，崔曉雪2，于淼2，王伊林2，龍杰2，趙強1

5-HT1B受體亞型對小腦頂核介導的運動行為的影響*

高偉1△，王楠2，喬虎2

(1．西安理工大學體育部，陜西西安710048;2．西安交通大學醫(yī)學部，陜西西安710061)

目的:探討5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)系統(tǒng)在經(jīng)小腦頂核介導的運動行為中的作用。方法:采用大鼠離體腦片膜片鉗及大鼠走步機的行為學測試方法。結(jié)果:阻斷5-HT1B受體能夠增強小腦頂核興奮性突觸傳遞，行為學試驗中給予5-HT及5-HT1B受體阻斷劑SB224289，發(fā)現(xiàn)注射5-HT到小腦頂核后，大鼠在Rota-rod走步機上的持續(xù)時間顯著延長，而給予其阻斷劑SB224289后，能夠反轉(zhuǎn)此作用。結(jié)論:5-HT很可能通過5-HT1B受體抑制頂核神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞從而調(diào)節(jié)小腦核團神經(jīng)元環(huán)路的活動，繼而影響小腦的最終輸出，實現(xiàn)對小腦頂核介導的運動平衡和協(xié)調(diào)能力的調(diào)控。

5-HT;5-HT1B受體;小腦頂核;興奮性突觸后電流;大鼠;膜片鉗

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)屬于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是中樞系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)。5-HT能神經(jīng)元起源于大腦中縫核、延髓及腦橋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，直接投射于小腦核團從而支配小腦皮層。而小腦皮層是參與運動調(diào)節(jié)的最主要的結(jié)構(gòu)之一，在動物的平衡控制、肌張力調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)個體動作的精準性和隨意運動控制中發(fā)揮重要作用［1-5］。小腦傳入信息經(jīng)過一系列整合和處理后，主要由小腦內(nèi)部深層核團接受。頂核(fastigial nucleus，F(xiàn)N)作為小腦深部的三大核團之一，能接受來自小腦皮層，苔狀纖維和爬行纖維的相關(guān)運動信息，以及包括5-HT能纖維傳入在內(nèi)的第三類傳入系統(tǒng)傳來的信息，從而控制軀干和肢體近端肌肉的運動［4-6］。但目前為止，中樞5-HT能傳入纖維對經(jīng)小腦頂核介導的運動行為的作用尚不明確，對其潛在的神經(jīng)機制仍不清楚。5-羥色胺受體家族龐大，依據(jù)其不同分子結(jié)構(gòu)及藥理學特性，迄今已發(fā)現(xiàn)14種不同亞型。這些受體都廣泛但不均一的分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，介導著腦內(nèi)興奮性或抑制性的神經(jīng)傳遞。其中5-HT1B受體廣泛分布于浦肯野(Purkinje)細胞上、或在投射到核團中的浦肯野細胞軸突終末或來自于苔狀纖維的谷氨酸能末梢上［7］。該受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。在突觸前與突觸后均有分布，可與Gi蛋白結(jié)合，抑制腺苷酸環(huán)化酶，下調(diào)cAMP生成，介導著腦內(nèi)興奮性或抑制性的神經(jīng)傳遞。5-HT1B受體可以調(diào)節(jié)5-HT的釋放，已被證明參與多種生理功能，主要包括運動積極性，運動協(xié)調(diào)性和情感行為［8，9］。但是5-HT1B受體對小腦神經(jīng)元的活動發(fā)揮何種效應?這種效應對運動行為產(chǎn)生什么樣的影響?均需要進行探討。為此，本研究采用大鼠離體腦片膜片鉗技術(shù)研究5-HT1B受體在小腦頂核興奮性突觸傳遞中的作用并觀察其對大鼠運動行為學的影響。

1 材料與方法

1．1材料

實驗動物均為健康雄性SD大鼠，來自西安交通大學動物中心。單籠飼養(yǎng)，自由進食進水，同時保證恒定溫度、濕度，光暗周期為12 h。根據(jù)“Principles of Laboratory Animal Care”(NIH publication no．85-23)和西安交通大學動物保護委員會制定的條例，整個實驗流程最大程度的減輕動物所受的痛苦和減少所用動物數(shù)量。實驗中需要的藥品用0．15%的DMSO將5-TH及拮抗劑SB224289溶解，并置于-20℃存儲。實驗時將其稀釋至所需濃度進行操作。

1．2小腦薄片的制備

將大鼠腹腔注射4%的水合氯醛(0．4 g/kg體重)麻醉，快速斷頭，用持針器剝離開顱骨，將腦組織取出，整個操作應該在冰上完成，控制時間在5 min左右。期間使用95%醫(yī)用氧氣將人工腦脊液充至飽和，最后將腦組織放入0℃的人工腦脊液靜置1 min，后沿矢狀面修剪掉一側(cè)小腦半球，用502膠水將另一半和瓊脂塊一起粘于振動切片機(DTK-1 000 DosakaEM，Japan)載物臺上，沿矢狀面切取厚度為300μm的腦片，之后將其放入通有95%醫(yī)用氧氣的孵育槽中，室溫下孵育1 h。為獲得活性狀態(tài)好的神經(jīng)元，制備腦片的整個過程越快越好，并且在冰上進行，用來剝離腦片的整套器械要提前預冷，以減少對腦組織的物理損傷。

1．3全細胞膜片鉗記錄

將孵育后的小腦薄片移入半浸式腦片灌流槽，將蠕動泵的流速調(diào)至2．2～2．6 ml/min，首先在低倍鏡(×10)下尋找記錄的位置。緩慢移動載物臺并結(jié)合大鼠腦圖譜，將視野移至大鼠小腦頂核區(qū)，之后切換到高倍鏡(水鏡×40)尋找表面光滑，輪廓清晰的神經(jīng)元，并將其移至視野正中央。找到細胞后，再次轉(zhuǎn)換回低倍鏡，安放電極。實驗中所用記錄電極是美國Sutter公司提供的電極(外徑是1．2 mm，內(nèi)徑是0．69 mm)。用水平拉制儀(P-87，Sutter，USA)采用兩次拉制，拉制的電極阻抗一般為2～4 MΩ。我們用含Cs電極內(nèi)液(其成分:單位mmol/L: Cs2SO4，110;CaCl2，0．5;MgCl2，2;EGTA，5; HEPES，5;etraethylammonium-Cl，5;)用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7．2～7．4，滲透壓為290～320 mOsm。打開測試方波，給予約4 ml空氣的正壓，使用微操使電極入水。當電極碰觸到細胞表面時，移去正壓，并給予負壓，封接成功，可以看到軟件界面的測試方波慢慢變?yōu)橐粭l直線，此時將鉗制電壓設為-70 mV，并且進行快電容補償(c-fast)，當封接電阻達到GΩ以上后，進行慢電容補償(c-slow)。準備破膜，破膜時可以看到快變電容所引起的兩個尖波在電壓鉗模式下，膜電位被鉗制到-70 mV以維持細胞正常的生理狀況。ACSF中加入20μmol/L的Bicuculline用來阻斷GABA受體介導的抑制性突觸后電流。雙鎢絲電極放在小腦蚓部皮質(zhì)，用頻率為0．025 Hz，持續(xù)時間為0．3 ms，刺激強度范圍為0．25～0．5 mA，通過每次0．05 mA階梯式增加刺激強度，根據(jù)最終反應結(jié)果確定最佳實驗刺激強度(最大反應幅值的50%)。待誘發(fā)的興奮性突觸后電流(eEPSCs)穩(wěn)定至少10 min后，用之前確定的最佳刺激強度誘發(fā)eEPSCs(對照組CP)，并將給藥后10 min記錄數(shù)據(jù)視為藥物組(PD)，然后洗脫10 min并將記錄數(shù)據(jù)標記為洗脫組(WO)。所有的記錄與刺激程序都通過美國Axon Digidata 1440A放大器控制。此外，實驗過程如果電阻Rs變化超過30%，或靜息膜電位小于-50 mV，則舍棄不用。

1．4動物手術(shù)

大鼠經(jīng)腹腔注射2．5%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)，待麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上，頭部剪毛備皮，用碘伏消毒，在大鼠腦部做一正中切口，暴露顱骨，用雙氧水進行傷口止血。根據(jù)大鼠腦立體定位儀圖譜，確定小腦頂核坐標，為前囟前11．4～11．6 mm，中線旁開1．2 mm，進針深度為5．4～5．6 mm。根據(jù)此坐標在大鼠雙側(cè)小腦頂核正上方打孔，將用于微量注射的兩根不銹鋼套管植入小腦內(nèi)，并用不銹鋼螺絲和牙科水泥將套管固定于顱骨上。手術(shù)后每只大鼠給予肌注兩萬單位青霉素抗感染，動物均單籠飼養(yǎng)，自由飲水取食。飼養(yǎng)間溫度維持在22℃～26℃，光照時間為12 h/d。整個實驗過程盡可能地減少對動物的傷害及所用動物的數(shù)量。

1．5行為學測試

本實驗中使用Rota-rod(XR1514-RZPR)走步機測試，大鼠隨機分為3組:Saline組(n=12)，5-HT組(n=10)，SB224289組(n=12)。所有大鼠均選擇上午9:00開始進行測試，在正式實驗前每只大鼠先進行連續(xù)5 d至少10次以上的訓練，用于穩(wěn)定大鼠的行為學實驗。測試分為4個階段:給藥前、給藥后5 min、給藥后4 h、給藥后24 h。

行為學實驗給藥時，先將實驗鼠放入小動物麻醉機(RWD isoflurane R580)的玻璃罩中，30 s后大鼠麻醉，將其取出用吸入式麻醉機的透明的面罩置于大鼠口鼻端后開始給藥。將Hamilton微量注射器的不銹鋼針插入套管，使其頂端超出套管末端2 mm，以保證注射位點正好落在頂核的表面。藥物每側(cè)注射1μl，持續(xù)注射2 min，結(jié)束后停針2 min。以利藥物充分吸收，退針后將套芯重新插入套管中。所用藥物包括:5-HT(50μmol/L)，選擇性5-HT1B受體阻斷劑SB224289(10μmol/L)，以及生理鹽水。分別注射到不同組別大鼠的雙側(cè)頂核，以評估小腦5-HT能神經(jīng)傳入對大鼠運動行為學的影響。根據(jù)Song YN相關(guān)研究［10］，1μl的注射量在核團內(nèi)的作用范圍不超過2．0 mm，因此，本實驗中注射藥物的有效范圍將局限在小腦頂核內(nèi)。給藥后恢復5 min (一般情況小動物麻醉機面罩去掉后，大鼠會迅速恢復清醒)，馬上進行單只大鼠5 min時間點的行為學實驗。大鼠首先在低速(4 r/min)狀態(tài)下適應30 s，然后將橫梁的轉(zhuǎn)速在3 min內(nèi)從4 r/min勻加速到60 r/min。在大鼠麻醉恢復期間可以進行下一只大鼠的給藥操作。將一個處理組所有給藥大鼠的實驗完成后。開始測量4 h時間點的行為數(shù)據(jù)，最后測量24 h的行為學數(shù)據(jù)。其中，24 h的測試時，每只大鼠測量3次，每次間隙5 min，以減少動物緊張和疲勞。

根據(jù)HeYC等研究確定5-HT和拮抗劑的使用初始濃度梯度［11］，預實驗中使用5-HT和拮抗劑的濃度分別為1μmol/L，10μmol/L、50μmol/L、100 μmol/L發(fā)現(xiàn)。給予50μmol/L的5-HT時，大鼠的在走步機的停留時間最長。拮抗劑使用10μmol/L濃度時，大鼠在走步機的停留時間最短。由此確定了行為學實驗的藥物濃度。

1．6統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用Origin 7．0作圖。膜片鉗數(shù)據(jù)利用Clampfit 9．0采集響應電流的幅度以CP最大幅值作為100%，PD和WO的計算公式為分別為:PD-CP/CP×100%及WO-CP/CP×100%。行為學數(shù)據(jù)用走步機計數(shù)器進行采集。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

離體腦片全細胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，給予5-HT1B受體拮抗劑SB224289(10μmol/L)時，相比于給藥前，誘發(fā)的興奮性突觸后電流(eEPSCs)波幅呈現(xiàn)顯著的增加。小腦頂核eEPSCs的幅度較給藥前分別增加(49．52±7．91)%(P＜0．05，圖1 a)，洗脫10 min后，eEPSCs的幅度恢復到給藥前的(104．99± 12．67)%(圖1b)。

2．2微量注射5-HT1B受體阻斷劑顯著對大鼠運動能力的影響

加速Rota-rod走步機測試顯示，給藥前34只大鼠的平均成績?yōu)?95．7±2．1)s。當注射5-HT到頂核5 min后，大鼠在Rota-rod走步機上的持續(xù)時間顯著延長(P＜0．01，圖2)，給藥后4 h和24 h后逐漸恢復到給藥前狀態(tài);而微量注射SB224289(n= 12)到小腦頂核5 min后，大鼠在走步機上停留的時間顯著縮短(P＜0．01，圖2)，同樣在給藥4 h和24 h后逐漸恢復到初始狀態(tài)。上述結(jié)果提示5-HT可以增強大鼠的運動能力，在這個過程中5-HT1B受體發(fā)揮了重要作用。

Fig．1 The analysis of the changes in excitatory synaptic transmission in the cerebella fastigial nucleus a．The scope of 5-HT1 receptor antagonist SB224289(10 μmol/L，n=10);b．The cartogram of SB224289(10 min，bias)and the eEPSCs of WO(10 min，grey)*P＜0．05 vs baseline group

Fig．2 Motor performances of rats in saline group，5-HT-injected group，SB224289-injected group in accelerating rotarod test(珋x±s)＊＊P＜0．01 vs saline group

2．1選擇性地阻斷5-HT1B受體對小腦頂核興奮性突觸傳遞的影響

3 討論

小腦5-HT能神經(jīng)傳入是繼苔狀纖維和爬行纖維外最大的傳入系統(tǒng)。但5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)在經(jīng)小腦介導的運動行為中所起的作用及其潛在的神經(jīng)機制有待研究。小腦中存在多種類型的5-HT受體，Yew等人發(fā)現(xiàn)小鼠小腦細胞層和分子層含有少量5-HT1A陽性細胞，5-HT2A陽性細胞數(shù)比較多，但是小鼠Purkinje細胞層中沒有5-HT1A及5-HT2 A受體［12］;大鼠小腦中有少量5-HT2A及5-HT2B mRNA表達［13］;同樣5-HT5A、5-HT4和5-HT6在小腦中的含量也非常低［14，15］。而Boschertd等研究發(fā)現(xiàn)在purkinje細胞主要分布著5-HT1B受體的mRNA，但是這些細胞受體結(jié)合位點很少，相反，在包含頂核在內(nèi)的小腦深部核團，也就是purkinje細胞投射的主要區(qū)域，才存在穩(wěn)定的受體結(jié)合位點［16］。Sari研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)使用縮氨酸抗體識別5-HT1B受體進行定位發(fā)現(xiàn)，最密集的5-HT1B受體免疫反應性發(fā)生在腹側(cè)蒼白球，蒼白球、黑質(zhì)。此外，中等密度的免疫反應性發(fā)生在小腦核團、上丘灰質(zhì)層和尾狀核［17］。Murano等［18］研究發(fā)現(xiàn)5-HT1B受體廣泛分布于浦肯野細胞上，小腦核團中也存在5-HT1B受體，主要分布在投射到核團中的浦肯野細胞軸突終末或來自于苔狀纖維的谷氨酸能末梢上。Singer等人［19］發(fā)現(xiàn)5-HT作用于突觸前5-HT1B受體，通過減少囊泡釋放的幾率抑制了舌下神經(jīng)核中谷氨酸介導的興奮性突觸傳遞。同樣突觸前5-HT1受體的激活可以抑制丘腦頂核興奮性及抑制性突觸后電流［20］。與前期文獻報道相一致，我們采用離體電生理技術(shù)，給予5-HT也使小腦頂核內(nèi)興奮性突觸傳遞效能被抑制，而選擇性地阻斷5-HT1B受體，興奮性突出傳遞效能增加。有研究發(fā)現(xiàn)，5-HT能夠通過激活苔蘚纖維突觸前終末的5-HT1B受體減少誘發(fā)的興奮性突觸后電流的幅度(eEPSCs)，在灌流液中加入5-HT后所誘發(fā)的LTD的幅度也是明顯減少的，提示5-HT不僅能夠短暫的抑制苔蘚纖維誘發(fā)的eEPSCs，并且在調(diào)節(jié)長時程突觸效能方面起著重要的作用［18］。因此可以看出，5-HT可以調(diào)節(jié)谷氨酸和GABA的釋放，而且很可能通過5-HT1B受體抑制核團神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞，從而調(diào)節(jié)小腦核團神經(jīng)元環(huán)路的活動，繼而影響到初級小腦環(huán)路的信息整合，以及脊髓小腦的最終輸出來實現(xiàn)對運動行為的調(diào)控。

中樞5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)在運動調(diào)控中起著重要的作用，目前在運動控制中心(蒼白球，黑質(zhì)和小腦的深核)發(fā)現(xiàn)了大量的5-HT1B受體，表明其參與了運動行為的調(diào)控［21，22］?；蚯贸?-HT受體后的小鼠在曠場實驗中減少了整個曠場的垂直探索和曠場中央的水平探索，在高架十字迷宮實驗中表現(xiàn)出在開放臂停留時間減少等不同程度的運動功能異常［23］，說明中樞5-HT的確參與了運動行為的調(diào)控。在本研究中，通過向小腦頂核微量注射的方法評估5-HT及其他5-HT能藥物對頂核介導的運動行為的影響，注射5-HT后，大鼠在Rota-rod走步機運動成績顯著提高。而注射5-HT1B的阻斷劑，以阻斷頂核內(nèi)內(nèi)源性5-HT傳入則顯著降低大鼠的運動能力。這些結(jié)果說明，5-HT或5-HT能傳入可以通過調(diào)節(jié)小腦核團神經(jīng)元環(huán)路的活動來增強大鼠的運動能力，在這一過程中5-HT1B受體發(fā)揮了重要的作用。因此，可以推測小腦5-HT能神經(jīng)傳入可以通過對小腦頂核神經(jīng)元環(huán)路的調(diào)節(jié)，影響小腦的最終輸出，從而實現(xiàn)對小腦介導的運動平衡和協(xié)調(diào)能力的調(diào)控。

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趙明1△，崔曉雪2，于淼2，王伊林2，龍杰2，趙強1

(1．內(nèi)蒙古民族大學第一臨床醫(yī)院，2．內(nèi)蒙古民族大學，通遼028000)

【摘要】目的:研究阿霉素損傷心肌細胞miRNA378與網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)性。方法:原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞分為6組:對照組、阿霉素組、miRNA378過表達對照組、miRNA378過表達組、miRNA378沉默對照組、miRNA378沉默組，采用免疫組化法檢測細胞α-SMA蛋白;慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心室肌細胞，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組心肌細胞miRNA378、calumenin及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)mRNA表達。結(jié)果:與阿霉素組相比較，miRNA378過表達組心肌細胞calumenin mRNA表達增加(P＜0．01)，而GRP78 mRNA表達減少(P＜0．01);與阿霉素組相比較，miRNA378沉默組calumenin及GRP78 mRNA表達無統(tǒng)計學差異。結(jié)論:阿霉素損傷乳鼠心肌細胞是通過減少calumenin蛋白表達進而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，該作用通過上調(diào)miRNA378得到緩解。

【關(guān)鍵詞】阿霉素;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;miRNA378;網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白;乳鼠

The effects of 5-HT1Breceptor subtypes on motor behaviors mediated by cerebellar fastigial nucleus

GAO Wei1△，WANG Nan2，QIAO Hu2
(1．Department of Physical Education，Xi＇an University of Technology，Xi＇an 710048; 2．Department of Physiology and Pathophysiology，Xi＇an Jiaotong University School of Medicine，Xi＇an 710061，China)

Objective:To investigate the effects of the serotonergic nervous system on motor behaviors mediated by cerebellar fastigial nucleus(FN)．Methods:In this experiment，the main methods are whole-cell patch clamp recording and Rota-rod test．Results:We found that the excitatory synaptic transmission was enhanced in the cerebella FN after blocking 5-hydroxytryptamine，(5-HT) receptor．Microinjection of5-HT into FNs remarkably promoted motor performances on Rota-rod，which could be reversed by microinjection of 5-HT receptor antagonist SB224289．Conclusion:These results suggest that the 5-HT can suppress cerebellar FN excitatory synaptic transmission via 5-HT1Breceptors，thereby modulate the activity of cerebellar nuclear neurons circuitry，and subsequently influence the cerebellum-mediated ongoing motor balance and coordination．

5-HT;5-HT1Breceptor;fastigial nucleus(FN);excitatory post-synaptic currents;rat;patch clamp

Q429【

】A【文章編號】1000-6834(2016)06-550-05

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．014

R331．3;R332【文獻標識碼】A

1000-6834(2016)06-555-04

國家自然科學基金項目(30900544)

2016-01-04

2016-05-26

△【通訊作者】Tel:029-82312959;E-mail:59073939@qq．com

【DOI】10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．015