多種細菌與凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)爆發(fā)有關(guān)*

黃志堅，陳勇貴，翁少萍, ，路曉鋒，鐘立洪，范文洲，陳旭凌，張慧文，何建國,

(1. 水產(chǎn)品安全教育部重點實驗室∥中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

多種細菌與凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)爆發(fā)有關(guān)*

黃志堅1，陳勇貴1，翁少萍1, 2，路曉鋒1，鐘立洪1，范文洲2，陳旭凌1，張慧文2，何建國1, 2

(1. 水產(chǎn)品安全教育部重點實驗室∥中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

近年來，在中國南方超過50%以上的凡納濱對蝦養(yǎng)殖場在養(yǎng)殖30 d后爆發(fā)1種疾病，導(dǎo)致80%以上的養(yǎng)殖對蝦死亡?；疾ξr臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動力減弱、對蝦在池塘底部死亡，發(fā)病初期水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此養(yǎng)殖者通常將該病稱為“偷死病”?；疾ξr肝胰腺萎縮壞死是主要癥狀，因此，我們稱這種對蝦疾病為對蝦肝胰腺壞死癥(hepatopancreas necrosis syndrome, HPNS)。2012年3月-2013年10月，我們在中國南方廣東、海南和廣西3個省的12個養(yǎng)殖地區(qū)采集具有HPNS癥狀的凡納濱對蝦進行了組織病理觀察、病毒檢測與人工感染、細菌分離鑒定與人工感染研究。組織病理學(xué)研究表明具有HPNS癥狀的病蝦肝胰腺壞死，在部分區(qū)域肝胰腺管細胞消失，肝胰腺小管間結(jié)締組織減少。對305尾HPNS對蝦進行11種對蝦病毒PCR檢測，并采用人工病毒感染方式感染健康對蝦，感染對蝦不表現(xiàn)HPNS癥狀。從63尾HPNS病蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離鑒定383株細菌，這些細菌分別屬于10個屬，49種細菌，每尾對蝦均混合感染多種細菌，其中38尾對蝦中分離到副溶血弧菌，34尾對蝦中分離到蠟樣芽孢桿菌，20尾對蝦中分離到蘇云金芽孢桿菌，19尾對蝦中分離到霍亂弧菌。選取副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌分別采用注射和浸泡方式感染健康對蝦，感染對蝦均出現(xiàn)HPNS癥狀。結(jié)果表明多種細菌與凡納濱對蝦HPNS爆發(fā)有關(guān)。

凡納濱對蝦；肝胰腺壞死癥；細菌；病毒

凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei現(xiàn)為世界第一大養(yǎng)殖對蝦種，占世界養(yǎng)殖對蝦總產(chǎn)量的70%。中國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量的30%，2012年中國養(yǎng)殖凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達到145.32萬t。近年來，一種稱為早期死亡綜合癥(early mortality syndrome, EMS)[1-3]或急性肝胰腺壞死綜合癥(acute hepatopancreas necrosis syndrome, AHPNS)[4-5]的對蝦疾病在中國、泰國、越南、印度尼西亞、印度和墨西哥等地對蝦養(yǎng)殖場中爆發(fā)[1-2,5-9]。EMS/AHPNS導(dǎo)致全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重損失[5,10-13]。最近在中國南方超過50%以上的凡納濱對蝦養(yǎng)殖場在養(yǎng)殖30 d后爆發(fā)1種疾病，導(dǎo)致80%以上的養(yǎng)殖對蝦死亡?；疾ξr臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動力減弱、在池塘底部死亡，水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此對蝦養(yǎng)殖者通常將該病稱為“偷死病”。肝胰腺萎縮壞死是患病對蝦的主要臨床癥狀，因此，我們稱這種對蝦疾病為對蝦肝胰腺壞死癥(hepatopancreas necrosis, HPNS)。盡管患有HPNS的對蝦與患有EMS/AHPNS的對蝦均表現(xiàn)為肝胰腺壞死，但HPNS對蝦與EMS/AHPNS對蝦不同，EMS/AHPNS是在對蝦養(yǎng)殖早期死亡(一般在7～30 d的養(yǎng)殖時間發(fā)病)，發(fā)病速度快，有報道認為EMS/AHPNS 是由1株高致病力的副溶血弧菌致病菌引起對蝦急性大量死亡[1,14-17]。與EMS/AHPNS相比，HPNS的爆發(fā)和發(fā)病進程相對比較緩慢，而且HPNS一般發(fā)生在凡納濱對蝦養(yǎng)殖30 d以后，池塘養(yǎng)殖對蝦不會在短時間內(nèi)大量死亡，而是逐漸死亡，養(yǎng)殖到90 d左右，死亡率達到80%。

為了研究對蝦HPNS爆發(fā)是否跟細菌和/或病毒等因素有關(guān)，本文開展了組織病理學(xué)、病毒檢測與人工感染、細菌分離鑒定與人工感染等方面的研究。

1 材料和方法

1.1 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦樣品采集

于2012年3月-2013年10月分別在中國南方廣東、海南和廣西3個省的12個凡納濱對蝦主要養(yǎng)殖區(qū)域收集具有典型HPNS癥狀的病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道樣品。為了檢測細菌或病毒病原，病蝦樣品分別在現(xiàn)場進行不同處理和保存。采用無菌操作方法現(xiàn)場取患病凡納濱對蝦的肝胰腺、血液、腸道，用接種環(huán)分別在LB、TSA、TCBS、BHI平板培養(yǎng)基上劃線接種，平板培養(yǎng)基密封保存帶回實驗室用于檢測和鑒定細菌?，F(xiàn)場采集的病蝦樣品用冰盒冷凍，封裝后帶回實驗室，存放于-80 ℃凍存用于對蝦DNA病毒檢測和病毒人工感染。同時取對蝦不同組織用RNA later液(Invitrogen, USA)于-80 ℃保存，用于對蝦RNA病毒檢測。采集患病對蝦樣品同時用Davidson’s AFA組織固定液[18-19]固定用于組織病理分析。

1.2 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦組織病理觀察

采集36尾HPNS對蝦肝胰腺，Davidson’s AFA組織固定液固定，固定12～24 h后換φ=70%酒精保存[19]。將固定的對蝦組織用無菌去離子水沖洗12 h，然后用φ為50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明、透蠟，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(H&E)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦病毒PCR檢測

采用酚氯仿法提取HPNS對蝦基因組DNA進行對蝦DNA病毒檢測[20]。采用Trizol法(Invitrogen，USA)提取HPNS對蝦總RNA，并用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄以檢測HPNS對蝦RNA病毒。針對各種對蝦病毒性病原的高度保守區(qū)段設(shè)計特異性引物，采用PCR檢測方法分別檢測白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、對蝦桿狀病毒(BPV)、斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)、肝胰腺細小病毒(HPV)、黃頭病毒(YHV)、桃拉綜合癥病毒(TSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、羅氏沼蝦諾達病毒衛(wèi)星病毒(XSV)和生長緩慢綜合癥病毒(LSNV)。對蝦病毒檢測所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分析。

表1 病毒檢測的引物序列

1.4 病毒人工感染

實驗所用健康凡納濱對蝦(均質(zhì)量5 g)由中山大學(xué)海洋生物技術(shù)研究開發(fā)中心珠?；靥峁?。選取容積為0.8 m3的水族箱，試驗用水為天然海水，水溫 28～32 ℃。選取大小均一適中、活力較好的對蝦放入水族箱暫養(yǎng)3～5 d，24 h充氣，每天按時喂料并吸污換水，直至對蝦生長狀況穩(wěn)定。感染試驗分組前，隨機選取10尾試驗對蝦進行對蝦病毒檢測，沒有檢測到病毒的對蝦可進行病毒攻毒試驗。

小心剝離30尾具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸甲，稱取病蝦頭胸部用10倍體積的無菌PBS用勻漿器在冰上勻漿，勻漿液在5 000 r/min離心10 min，上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，10倍體積PBS液稀釋用于對蝦感染。實驗健康對蝦分為過濾組、未過濾組和對照組3個組，每個組設(shè)3個平行組，每個平行組30尾對蝦。過濾組和未過濾組分別用0.5 mL過濾液和未過濾液稀釋液注射感染健康對蝦，對照組注射等量無菌PBS緩沖液，觀察7 d。感染7 d后，每個平行組隨機選取5尾對蝦進行病毒檢測。

1.5 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌分離和鑒定

從HPNS病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道分離的細菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢單一菌落在培養(yǎng)基中再次劃線純化和培養(yǎng)，直至獲得純化的單一菌落。采用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法[21]進行細菌鑒定。細菌16S rDNA基因擴增[22]采用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen, Beijing)提取細菌基因組DNA。16S rDNA擴增反應(yīng)的引物為通用引物，正向引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′，由上海英駿生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后于72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海英駿公司測序，測序結(jié)果用BLAST軟件進行同源性比對，Clustal X軟件進行多序列比對，MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，以進行細菌種類鑒定和分析。

1.6 副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染凡納濱對蝦

選取來源于HPNS對蝦肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和來源于HPNS對蝦腸道的蘇云金芽孢桿菌(BT)，分別采取肌肉注射感染及浸泡感染方式進行凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥細菌人工感染。

注射感染對蝦分為4個組，每個組設(shè)3個平行組，每個平行組30尾對蝦，分別注射細菌濃度為106CFU·mL-1的VP、BT和VP+BT 菌液50 μL/尾，對照組對蝦注射等量無菌PBS，注射劑量均為50 μL/尾。浸泡感染也分為4個組，每個組設(shè)3個平行組，每個平行組30尾對蝦，感染對蝦分別用細菌終濃度為105CFU.mL-1的VP、BT和VP+BT 菌液浸泡，對照組用天然海水浸泡。不同方式感染對蝦觀察14 d，記錄對蝦感染癥狀和死亡情況，從感染對蝦中分離和鑒定細菌，同時取感染對蝦組織用AFA組織固定液固定，用常規(guī)組織學(xué)方法進行組織病理學(xué)檢測[19]。

2 結(jié) 果

2.1 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦癥狀和組織病理觀察

患HPNS對蝦的主要癥狀是活力減弱，攝食減弱或不攝食，肝胰腺邊緣不清晰呈彌散狀，最后肝胰腺萎縮壞事(圖1-a, 圖1-a’)。與健康凡納濱對蝦(圖1-b，圖1-b’，圖1-c)比較，患病對蝦肝胰腺肝小管B，F(xiàn)，R細胞壞死或脫落，肝小管間結(jié)締組織松散或壞死，嚴(yán)重者肝小管崩解(圖1-d)。

圖1 HPNS對蝦癥狀和組織病理觀察Fig.1 Symptoms and histopathology observation of shrimp with the symptoms of HPNS

2.2 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦病毒檢測和人工感染

采用PCR方法針對305尾具有HPNS癥狀的患病對蝦進行對蝦病毒檢測攜帶情況。檢測結(jié)果顯示，可檢測到WSSV、IHHNV 2種病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9種病毒在所有樣品中均未檢測出。其中WSSV一擴中未檢出，僅在二擴中檢出，二擴檢出率為66.7%，IHHNV僅檢出2例。

選取具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸部組織制備組織勻漿液，分別用不經(jīng)微孔濾膜過濾的組織勻漿液和經(jīng)微孔濾膜過濾的組織勻漿液注射感染健康對蝦，感染后7 d統(tǒng)計結(jié)果，未過濾組對蝦死亡率達到100%，表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀，過濾組對蝦在實驗期內(nèi)沒有死亡。對照組對蝦在實驗期內(nèi)也沒有死亡。感染結(jié)果表明病毒不是HPNS的主要病因。

2.3 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌分離鑒定

從63尾具HPNS癥狀的對蝦不同組織中分離鑒定49種細菌，分別屬于10個屬。所有這些細菌中，肝胰腺分離鑒定34種細菌，腸道31種，血淋巴39種(表2)。

其中弧菌屬Vibrio10種，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈維氏弧菌V.harveyi、溶藻弧菌V.alginolyticus、霍亂弧菌V.cholera、河流弧菌V.fluvialis、創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus、弗尼斯弧菌V.furnissii、遠青弧菌V.azureus、需鈉弧菌V.natriegens、擬態(tài)弧菌V.mimicus；芽孢桿菌屬Bacillus11種，包括蠟樣芽孢桿菌B.cereus、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens、地衣芽孢桿菌B.licheniformis、蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis、枯草芽孢桿菌B.subtilis、高地芽孢桿菌B.altitudinis、死谷芽孢桿菌B.vallismortis、巨大芽孢桿菌B.megaterium、彎曲芽孢桿菌B.flexus、韓國芽孢桿菌B.koreensis、南海恩施芽孢桿菌B.ensch；氣單胞菌屬Aeromonas7種，包括豚鼠氣單胞菌A.caviae、嗜水氣單胞菌A.hydrophila、維羅納氣單胞菌A.veronii、溫和氣單胞菌A.sobria、斑點氣單胞菌A.punctata、舒氏氣單胞菌A.schubertii、腸棕氣單胞菌A.enteropelogenes；微小桿菌屬Exiguobacterium5種，包括印度微小桿菌E.indicum、金橙黃微小桿菌E.aurantiacum、乙酰微小桿菌E.acetylicum、深海微小桿菌E.profundum、海洋微球菌E.marinum；葡萄球菌屬Staphylococcus6種，包括沃氏葡萄球菌S.warneri、木糖葡萄球菌S.xylosus、巴氏葡萄球菌S.pasteuri、路鄧葡萄球菌S.lugdunensis、松鼠葡萄球菌S.sciuri、腐生葡萄球菌S.saprophyticus；不動桿菌屬Acinetobacter3種，包括約氏不動桿菌A.johnsonii、泛耐藥鮑曼不動桿菌A.baumnnii、溶血不動桿菌A.heamolyticus；希瓦氏菌屬Shewanella3種，包括脫色希瓦氏菌S.decolorationis、海藻希瓦氏菌S.algae、鮑希瓦氏菌S.haliotis；發(fā)光桿菌屬Photobacterium2種，包括美人魚發(fā)光桿菌P.damselae和鰒發(fā)光桿菌P.leiognathi；腸桿菌屬Enterobacter 1種，阿氏腸桿菌Enterobacter asburiae；假單胞菌屬Pseudomonas1種，包括彎曲假單胞菌P.geniculate。

在63尾患病對蝦中，38尾對蝦中鑒定有副溶血弧菌V.parahaemolyticus，其余25尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數(shù)的60.3%；有蠟樣芽孢桿菌B.cereus的對蝦34尾，其余29尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數(shù)的54.0%；有蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis的對蝦20尾，其余43尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數(shù)的31.8%；有霍亂弧菌V.cholera的對蝦19尾，其余44尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數(shù)的30.2%；有金橙黃微小桿菌E.aurantiacum的對蝦14尾，占鑒定對蝦總數(shù)的22.2%；有嗜水氣單胞菌A.hydrophila的對蝦11尾，占鑒定對蝦總數(shù)的17.5%；解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens的對蝦為7尾，分別占鑒定對蝦總數(shù)的11.1%；其他種細菌分別從一些HPNS單尾蝦中分離鑒定(表2)。不同種類細菌可以從不同的單尾HPNS病蝦中分離，單尾HPNS病蝦中最多鑒定細菌9種，最少鑒定細菌3種。以上結(jié)果表明多種細菌可能與對蝦HPNS爆發(fā)有關(guān)。

2.4 肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌人工感染

用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別注射感染健康對蝦，在感染后6 d全部死亡，死亡率100%，表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀。對照組死亡率為12%，沒有肝胰腺壞死癥狀(圖2)。用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別浸泡感染健康對蝦，感染組對蝦緩慢死亡，在感染后14 d統(tǒng)計結(jié)果，VP+BT混合菌感染組對蝦死亡率較高，達到75%，VP感染組對蝦死亡率達到66%，BT感染組對蝦死亡率為62%，感染組死亡對蝦表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀。對照組死亡率為16%，沒有肝胰腺壞死癥狀(圖3)。

表2 63尾HPNS對蝦肝胰腺、腸道和血淋巴中分離鑒定的細菌

續(xù)表2對蝦編號肝胰腺腸道血淋巴019蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，霍亂弧菌V．cholera金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantia?cum，海洋微球菌E．marinum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus斑點氣單胞菌A．punctata，木糖葡萄球菌S．xylosus020霍亂弧菌V．cholera，海洋微球菌E．mari?num，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis木糖葡萄球菌S．xylosus，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis021木糖葡萄球菌S．xylosus，海洋微球菌E．marinum木糖葡萄球菌S．xylosus，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis022蠟樣芽孢桿菌B．cereus，需鈉弧菌V．natr?iegens，副溶血弧菌V．parahaemolyticus蘇云金芽孢桿菌B．thuringien?sis，霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus遠青弧菌V．a(chǎn)zureus，蠟樣芽孢桿菌B．cereus023蠟樣芽孢桿菌B．cereus，霍亂弧菌V．chol?era，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，蠟樣芽孢桿菌B．cereus，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes024副溶血弧菌V．parahaemolyticus，霍亂弧菌V．cholera霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus蠟樣芽孢桿菌B．cereus，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis025枯草芽孢桿菌B．subtilis，舒氏氣單胞菌A．schubertii腸棕氣單胞菌A．enteropelo?genes，副溶血弧菌V．parahae?molyticus金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，蠟樣芽孢桿菌B．cereus026副溶血弧菌V．parahaemolyticus，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，弗尼斯弧菌V．furnissii027副溶血弧菌V．parahaemolyticus，遠青弧菌V．a(chǎn)zureus副溶血弧菌V．parahaemolyticus創(chuàng)傷弧菌V．vulnificus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus028深海微小桿菌E．profundum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus深海微小桿菌E．profundum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus木糖葡萄球菌S．xylosus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，嗜水氣單胞菌A．hydrophila029豚鼠氣單胞菌A．caviae，蠟樣芽孢桿菌B．cereus蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus需鈉弧菌V．natriegens，豚鼠氣單胞菌A．caviae030副溶血弧菌V．parahaemolyticus，路鄧葡萄球菌S．lugdunensis嗜水氣單胞菌A．hydrophila，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes，需鈉弧菌V．natriegens嗜水氣單胞菌A．hydrophila，需鈉弧菌V．natriegens031嗜水氣單胞菌A．hydrophila，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum鰒發(fā)光桿菌P．leiognathi，溶血不動桿菌A．heamolyticus，需鈉弧菌V．natriegens需鈉弧菌V．natriegens，霍亂弧菌V．cholera，脫色希瓦氏菌S．decol?orationis032溶藻弧菌V．a(chǎn)lginolyticus，溶血不動桿菌A．heamolyticus，擬態(tài)弧菌V．mimicus巴氏葡萄球菌S．pasteuri，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，溶藻弧菌V．a(chǎn)lginolyticus約氏不動桿菌A．johnsonii，鰒發(fā)光桿菌P．leiognathi，蠟樣芽孢桿菌B．cereus033嗜水氣單胞菌A．hydrophila，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum，約氏不動桿菌A．johnsonii腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum，蠟樣芽孢桿菌B．cereus

圖2 副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌注射感染對蝦的情況Fig.2 Mortality of the shrimp injected by V. parahaemolyticus (VP), B. thuringiensis (BT) and VP + BT both bacteria

圖3 副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染對蝦的情況Fig.3 Mortality of the shrimp immersed by V. parahaemolyticus (VP), B. thuringiensis (BT) and VP + BT both bacteria

取不同感染方式感染對蝦進行病毒PCR檢測，未檢查到病毒。感染對蝦重新進行細菌分離和鑒定，V1感染組對蝦中分離鑒定出副溶血弧菌，Z7感染組對蝦中分離鑒定出蘇云金芽孢桿菌，V1+Z7混合感染組分離鑒定的細菌有副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌，兩種細菌都可以分別從人工感染對蝦中對應(yīng)重新分離。這些結(jié)果表明副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌都可以感染健康對蝦產(chǎn)生HPNS癥狀。

分別用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT以及兩者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康對蝦，病蝦均能產(chǎn)生與對蝦自然發(fā)病的HPNS癥狀：攝食減少或不攝食，肝胰腺萎縮，B、F、R細胞壞死(圖4)。

3 討 論

有報道采用PCR方法證明WSSV、YHV、IMNV和TSV等對蝦病毒不是EMS的病因[8]。在本研究中我們運用PCR方法檢測HPNS病蝦11種對蝦病毒，只有WSSV和IHHNV 2種病毒可檢測出，但病毒人工感染對蝦并沒有產(chǎn)生HPNS。因此對蝦HPNS不是由單一病毒引起的。

為了確定HPNS產(chǎn)生是否與細菌有關(guān)，我們采集63尾HPNS病蝦進行細菌分離鑒定，細菌可以從每一尾對蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離，經(jīng)鑒定，這些細菌屬于10個屬，沒有單一的一種細菌可以從所有63尾HPNS病蝦中分離。比如，副溶血弧菌只從其中的38尾對蝦中分離到，蠟樣芽孢桿菌從其中34尾對蝦中分離到，蘇云金芽孢桿菌從其中20尾對蝦分離到，霍亂弧菌從其中19尾對蝦分離到。我們選擇副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染健康對蝦，所有發(fā)病對蝦均表現(xiàn)HPNS癥狀。結(jié)果表明HPNS產(chǎn)生與多種細菌種類有關(guān)。

為什么HPNS產(chǎn)生會與多種細菌有關(guān)呢？我們認為這要歸結(jié)于水體理化因子和有毒藻類的脅迫。HPNS爆發(fā)與水體理化因子(如氨氮，亞硝酸鹽等)密切相關(guān)。在氨和亞硝酸鹽濃度較高的養(yǎng)殖池塘越容易爆發(fā)HPNS感染。如果爆發(fā)HPNS疾病，減料停料可以有效降低養(yǎng)殖水體氨氮濃度并有效控制疾病的產(chǎn)展(未發(fā)表數(shù)據(jù))。如果養(yǎng)殖池塘有毒藻類爆發(fā)，HPNS也會產(chǎn)生(未發(fā)表數(shù)據(jù))。在對蝦養(yǎng)殖中，減料和/或減少養(yǎng)殖密度將降低HPNS爆發(fā)的風(fēng)險，而且對蝦和不同魚類(羅非魚、草魚、胡子鯰等)混養(yǎng)可以有效改善養(yǎng)殖環(huán)境并且降低HPNS爆發(fā)的風(fēng)險(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，我們認為對蝦養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)平衡被打破是HPNS爆發(fā)的根本原因，養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致條件致病菌大量產(chǎn)生和氨氮脅迫，對蝦處于亞健康狀態(tài)，多種細菌包括在非脅迫條件下不能感染對蝦的細菌也可以感染對蝦。環(huán)境脅迫及導(dǎo)致條件致病菌繁生的生態(tài)系統(tǒng)是對蝦發(fā)生HPNS的根本原因。

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Multiple bacteria species were involved in hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS) ofLitopenaeusvannamei

HUANGZhijian1,CHENYonggui1,WENGShaoping1, 2,LUXiaofeng1,ZHONGLihong1,FANWenzhou2,CHENXuling1,ZHANGHuiwen2,HEJianguo1, 2

(1. MOE Key Laboratory of Aquatic Product Safety∥School of Marine Sciences,Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

In recent years, a disease outbreak occurred in >50 percent ofLitopenaeusvannameifarms at about 30 days after frys are released into the ponds in southern China. About 80% culture shrimps were dead in culture period. The clinical symptoms of the diseased shrimps include atrophy and necrosis of the hepatopancreas, weakened activity, and shrimp found dead in the bottom of the pond. The farmers in China usually called this symptom as “hidden death disease”. Since hepatopancreas atrophy and necrosis are the main symptoms of the disease, so we called this disease as hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS). In March 2012 to October 2013, we have collected the diseasedL.vannameiwith the symptoms of HPNS in 12 farms from Guangdong, Hainan and Guangxi provinces, China. Histopathology showed necrosis of hepatopancreas of the diseased shrimps, disappearance of some hepatopancreatic epidermal cells, and connective tissue. We used PCR to detect the presence of 11 viruses in 305 HPNS shrimps and performed artificial viral infection to healthy shrimps. The artificially infected shrimps did not show symptoms of HPNS. A total of 383 bacteria strains were identified from hepatopancreas, hemolymph and intestine of 63 diseased shrimps. These bacteria belong to 10 genera, 49 species. We isolatedVibrioparahaemolyticusfrom 38 shrimps,Bacilluscereusfrom 34 shrimps,B.thuringiensisfrom 20 shrimps andV.cholerafrom 19 shrimps. Injection and immersion ofV.parahaemolyticusandB.thuringiensiscan cause symptoms of HPNS. The results suggest that multiple bacteria were involved in HPNS ofL.vannamei.

Litopenaeusvannamei; hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS); bacterium; virus

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.01.001

2015-12-14

國家基金聯(lián)合基金資助項目(U1131002)；國家科技支撐資助項目(2012BAD17B03)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資助資金(CARS-47)；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費資助項目(201103034)；廣東省科技計劃資助項目(2012A020602084)；廣州市科技計劃資助項目(201510010071)

黃志堅(1970年生)，男；陳勇貴(1969年生)，男；翁少萍(1963年生)，女；以上3人并列第一作者；通訊作者：何建國；E-mail:lsshjg@mail.sysu.edu.cn

S941.42

A

0529-6579(2016)01-0001-11