不同劑量右美托咪定對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

呂少君　翁　浩　劉海健　劉　榮　齊　樂　徐志勇

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東　廣州　510515)

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不同劑量右美托咪定對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

呂少君1翁浩1劉海健1劉榮1齊樂1徐志勇1

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515)

〔摘要〕目的探討不同劑量右美托咪定對新西蘭大白兔脊髓缺血再灌注損傷(SCII)的影響。方法按照隨機(jī)數(shù)字表法將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、SCII對照組(C組)、低劑量、中劑量和高劑量右美托咪定組(D1組、D2組和D3組)，采用改良Zivin法制作SCII模型。再灌注48 h后，采用Tarlov評分法評估兔后肢運(yùn)動(dòng)功能，同時(shí)測定脊髓超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平表達(dá)，并作蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理變化和脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。結(jié)果不同組別Tarlov評分及脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的總體數(shù)量的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與S組比較，其他各組Tarlov評分及脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量均降低(P<0.05)；與C組比較，D1、D2和D3組上述兩指標(biāo)均升高(P<0.05)；與D2組比較，D3組均降低(P<0.05)。不同組別脊髓SOD和MDA的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與S組比較，其他各組脊髓SOD水平均降低，MDA水平均升高(P<0.05)。與C組比較，D1組、D2組和D3組脊髓SOD水平均升高，MDA水平均降低(P<0.05)。與D2組比較，D3組脊髓SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示各組病理變化與上述指標(biāo)變化一致。結(jié)論右美托咪定用于新西蘭大白兔SCII，能夠改善其運(yùn)動(dòng)功能，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧自由基的產(chǎn)生，以D2組效果最好，D3組未顯示出顯著的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕右美托咪定；脊髓缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是神經(jīng)損傷的重要因素〔1〕。SCII發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但相關(guān)研究證實(shí)〔2〕，其發(fā)生與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、前列腺素、鈣離子超載等多因素有關(guān)。脊柱損傷患者中，SCII的發(fā)生率高達(dá)14%〔3〕。脊柱畸形、脊髓腫瘤、椎管狹窄病變等手術(shù)均會(huì)出現(xiàn)導(dǎo)致SCII。右美托咪定屬于一種高效的腎上腺受體激動(dòng)劑，具有良好的鎮(zhèn)靜作用〔4〕。同時(shí)，對創(chuàng)傷性脊髓損傷和卒中模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能與其降低過量生成的氧自由基有關(guān)。本研究旨在探討不同劑量右美托咪定對新西蘭大白兔SCII的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及造模50只健康雄性新西蘭大白兔，4～5月齡，清潔級，體重2.5～3.0 kg。所有動(dòng)物自由進(jìn)食和水，12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、SCII對照組(C組)、低劑量、中劑量和高劑量右美托咪定組(D1組、D2組和D3組)，每組10只。采用改良Zivin法制作SCII模型。操作步驟如下：常規(guī)碘伏消毒。腹部備皮，取腹正中切口，在劍突下2.5 cm至恥骨聯(lián)合上5 cm，逐層分離腹壁，進(jìn)入腹腔，以生理鹽水紗墊覆蓋腸管，確認(rèn)腹主動(dòng)脈和左腎動(dòng)脈，鈍性分離腹主動(dòng)脈。在左腎動(dòng)脈下0.5～1 cm處夾閉腹主動(dòng)脈，監(jiān)測股動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓，30 min后開放腹主動(dòng)脈。術(shù)畢，以慶大霉素8萬IU和甲硝唑10 ml沖洗腹腔，縫合切口。S組不阻斷腹主動(dòng)脈，僅行麻醉和手術(shù)操作；C組阻斷腹主動(dòng)脈30 min后開放灌注；D1、D2組分別以2.5 μg/kg、10 μg/kg、40 μg/kg劑量持續(xù)泵注1 h。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1運(yùn)動(dòng)功能測定再灌注48 h后，按照Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，由不知情的專門人員進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。Tarlov評分0～4分：后肢完全失去感覺為0分；有微弱后肢活動(dòng)為1分；后肢僅能對抗重力為2分；后肢可正常承重站立但無法奔跑為3分；后肢功能完全恢復(fù)為4分。0分、1分為截癱。

1.2.2超氧化物歧化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)水平測定再灌注48 h時(shí)，做完Tarlov評分后，兔子在全麻下取左側(cè)臥位，背部后正中切口，逐層剝離椎旁肌、暴露出各段棘突，以咬骨鉗咬斷棘突和椎板，暴露至脊髓硬膜，分離并取出脊髓 L2～6節(jié)段。將取出脊髓在冰面上快速按節(jié)段分為兩份，標(biāo)記后，L2～4節(jié)段置入液氮中保存；L5～6節(jié)段以10%中性甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋、制片。取0.2 g保存在液氮中的脊髓組織，去除液體后稱重，按照1∶9的比例加入冰鹽水制成勻漿液，平均分成兩部分，第一部分3 000 r/min離心20 min，取上清液測定SOD活性；第二部分500 r/min離心5 min，取上清液測定MDA含量。

1.2.3脊髓蘇木素-伊紅(HE)染色及正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的計(jì)數(shù)L5～6節(jié)段石蠟包埋HE染色后組織病理學(xué)及脊髓前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)：由一位對實(shí)驗(yàn)情況并不知情的病理專業(yè)人員在200倍光鏡下觀察脊髓損傷病理改變，隨機(jī)選一前角，以此為頂點(diǎn)做支線與中央管的中點(diǎn)處相連接作為軸線，從該軸線出發(fā)，由外而內(nèi)取3個(gè)連續(xù)視野，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行正常神經(jīng)元的計(jì)數(shù)(同時(shí)符合以下3條標(biāo)準(zhǔn)者為正常神經(jīng)元)：①呈多角形，胞質(zhì)染為紅色，內(nèi)有正常的尼氏體；②胞核居中，呈圓形，輪廓清晰，核仁明顯；③胞體直徑30～60 μm。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法和秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同組別運(yùn)動(dòng)功能比較不同組別Tarlov評分及脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的總體數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.21、58.69，P<0.05)。與S組比較，其他各組Tarlov評分及脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量均降低(P<0.05)；與C組比較、D1、D2

和D3組上述兩指標(biāo)均升高(P<0.05)；與D2組比較，D3組均降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組兔脊髓SOD和MDA水平比較各組兔脊髓SOD和MDA水平的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.61，40.14，P<0.05)。與S組比較，其他各組脊髓SOD水平均降低，MDA水平均升高(P<0.05)。與C組比較，D1組、D2組和D3組脊髓SOD水平均升高，MDA水平均降低(P<0.05)。與D2組比較，D3組脊髓SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)。見表2。

表1　不同組別兔運(yùn)動(dòng)功能指標(biāo)比較±s,n=10)

與S組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05；與D2組比較：3)P<0.05，下表同

表2　不同組別兔脊髓SOD和MDA水平比較

2.3不同組別光鏡下脊髓前角的病理學(xué)結(jié)果S組前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚，胞核完整清晰，正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)元周圍形成的空泡較少，胞質(zhì)染色均勻。與S組比較，其他各組的HE染色結(jié)果都顯示為脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清，都有不同程度的破壞，胞核不清或有固縮和溶解，正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量都有不同程度的減少，神經(jīng)元周圍形成的空泡增多，胞質(zhì)染色不均。其中以C組的HE染色結(jié)果破壞最為明顯，正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量最少。與C組比較，D1組、D2組和D3組的HE染色結(jié)果都顯示出不同程度的改善和損失減少，但D3組改善不明顯且有惡化前兆。見圖1。

圖1　各組脊髓前角的病理學(xué)結(jié)果(HE，×200)

3討論

脊髓神經(jīng)細(xì)胞對缺血、缺氧等因素異常敏感，短暫的缺血缺氧即能引起脊髓細(xì)胞的壞死和脊髓功能損傷，其作用過程主要通過自由基氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6〕。檢測SOD和MDA水平能夠反映抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化程度〔7〕。右美托咪定除了常規(guī)的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮，抑制交感神經(jīng)，降低應(yīng)激反應(yīng)作用外，還有明顯的器官保護(hù)和抗氧化應(yīng)激作用〔5〕。Kocoglu等〔8〕對小鼠心臟建模缺血再灌注后發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可顯著減少小鼠心肌梗死面積；Okada等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定注射能夠顯著降低冠狀動(dòng)脈的血流量，減少梗死面積。

本研究結(jié)果與Freeman等〔10〕研究結(jié)果一致，說明右美托咪定能夠一定程度上改善兔的運(yùn)動(dòng)功能。另外本研究與王赫等〔11〕的研究結(jié)果相似，說明右美托咪定能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧自由基的生成，減少對脊髓神經(jīng)元的損傷，從而對缺血再灌注的脊髓起到保護(hù)作用。

本研究提示右美托咪定對兔脊髓SCII的保護(hù)存在一個(gè)最佳劑量(中劑量)，其保護(hù)作用不是呈線性升高，可能具有“封頂效應(yīng)”。高劑量的右美托咪定對缺血再灌注的脊髓的保護(hù)作用不一定有顯著作用，推測可能是高劑量的右美托咪定對機(jī)體的血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生不利影響，減少再灌注后的血流量等諸多因素有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1Bell MT,Puskas F,Bennett DT,etal.Dexmedetomidine,an α-2a adrenergic agonist,promotes ischemic tolerance in a murine model of spinal cord ischemia-reperfusion〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg,2014;147(1):500-6.

2黃海燕,陳克研,孫瑩杰,等.右美托咪定對大鼠腎缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的影響〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志,2014;34(2):230-2.

3陳月,張加強(qiáng),孟凡民,等.右美托咪定對肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的影響〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2015;35(12):1113-5.

4田麗穎,張振,王君,等.HIF-1α與BMSCs治療SCⅡ的研究現(xiàn)狀與展望〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013;13(1):173-6.

5韓超,葛志軍,江文杰,等.咪達(dá)唑侖、丙泊酚、右美托咪定對食管癌根治術(shù)圍術(shù)期氧化應(yīng)激反應(yīng)影響的比較〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志,2013;29(12):1193-5.

6Fang B,Li XQ,Bi B,etal.Dexmedetomidine attenuates blood-spinal cord barrier disruption induced by spinal cord ischemia reperfusion injury in rats〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;36(1):373-83.

7Juranek I,Bezek S.Controversy of free radical hypothesis:reactive oxygen species-cause or consequence of tissue injury〔J〕?Gen Physiol Biophys,2005;24(3):263-78.

8Kocoglu H,Karaaslan K,Gonca E,etal.Preconditionin effects of dexmedetomidine on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Curr Ther Res Clin Exp,2008;69(2):150-8.

9Okada H,Kurita T,Mochizuki T,etal.The cardioprotective effect of dexmedetomidine on global ischaemia in isolated rat hearts〔J〕.Resuscitation,2007;74(3):538-45.

10Freeman KA,Fullerton DA,Foley LS,etal.Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg,2015;149(2):578-84.

11王赫,李曉倩,馬虹,等.鞘內(nèi)注射右美托咪啶預(yù)處理在兔脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國醫(yī)師雜志,2013;15(8):1032-6.

〔2015-08-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：上海市奉賢區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金項(xiàng)目(No.FK20111105)

通訊作者：翁浩(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事器官缺血再灌注損傷保護(hù)方面的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2069-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.009

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院麻醉科

第一作者：呂少君(1982-)，男，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事器官缺血再灌注損傷保護(hù)方面的研究。