化痰通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死溶栓后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子的影響

劉　爽　周　震　張玉蓮　張琳琳　宋宛珊　王　凱　孫偉明

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津　300150)

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化痰通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死溶栓后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子的影響

劉爽周震張玉蓮張琳琳宋宛珊1王凱1孫偉明1

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150)

〔摘要〕目的觀察化痰通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死大鼠重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)相關(guān)分子基因和蛋白表達(dá)的影響，探討化痰通絡(luò)方調(diào)控急性腦梗死溶栓后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制。方法將160只健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、rt-PA 組、rt-PA+化痰通絡(luò)組，每組40只，采用自身栓子法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)，rt-PA組與rt-PA+化痰通絡(luò)組于血栓注入后3 h一次性予以rt-PA溶栓治療，后者聯(lián)合給予9 ml/kg化痰通絡(luò)方濃縮劑灌胃治療，每日2次，分別于造模后6 h，1 d，3 d，7 d 4個(gè)時(shí)點(diǎn)，應(yīng)用Western印跡法及熒光定量PCR檢測(cè)UPR相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點(diǎn)IRE1、PERK、ATF6蛋白和基因及GRP78/BiP基因表達(dá)水平。結(jié)果同一組內(nèi)，與6 h相比，各組IRE1基因和蛋白均以6 h時(shí)表達(dá)量最高(P<0.05)，各組PERK、ATF6基因和蛋白與BiP蛋白以1 d時(shí)表達(dá)量最高(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組在4個(gè)時(shí)相中各指標(biāo)的表達(dá)量均較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組、rt-PA+化痰通絡(luò)組IRE1基因和蛋白、BiP基因表達(dá)量增高(P<0.05)，PERK、ATF6基因和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；rt-PA+化痰通絡(luò)組IRE1基因和蛋白、BiP蛋白表達(dá)量高于rt-PA組，且以6 h、1 d、3 d差異顯著(P<0.05)；PERK基因和蛋白表達(dá)與rt-PA組無明顯差異(P>0.05)；rt-PA+化痰通絡(luò)組ATF6基因和蛋白表達(dá)量低于rt-PA組，且以3、7 d差異顯著(P<0.05)。結(jié)論化痰通絡(luò)方可能通過調(diào)控急性腦梗死溶栓后大鼠腦組織ERS中 UPR靶分子IREI、BiP的表達(dá)，進(jìn)而起到防止缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕化痰通絡(luò)方；缺血再灌注；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；未折疊蛋白反應(yīng)

早期溶栓是治療急性腦梗死最有效的方法〔1，2〕，可以有效降低腦梗死死亡率與致殘率〔3〕。然而，腦缺血再灌注繼發(fā)性損傷嚴(yán)重限制了急性腦梗死溶栓治療的推廣應(yīng)用。腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)〔4〕。而作為對(duì)ERS的響應(yīng)，細(xì)胞在進(jìn)化過程中形成了一條高度自我保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，包括誘導(dǎo)分子伴侶的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)翻譯減少等〔5，6〕。UPR的作用具有雙重性，即在ERS早期恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、維持生存，以保護(hù)細(xì)胞；但是長時(shí)間過強(qiáng)的刺激則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑，即在晚期產(chǎn)生病理損害〔7〕。我們前期研究發(fā)現(xiàn)化痰通絡(luò)方聯(lián)合溶栓治療可減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫，明顯縮小大鼠腦梗死的面積和體積，減少腦組織含水量，改善急性腦梗死大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的變化〔8～10〕，但對(duì)于急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷大鼠大腦梗死部位腦組織UPR重要靶點(diǎn)的影響未予報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察化痰通絡(luò)方中藥對(duì)缺血半暗帶區(qū)ERS后UPR相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康SD大鼠160只，雌雄各半，體重200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物化痰通絡(luò)方中藥處方：天麻10 g，半夏10 g，膽南星5 g，丹參30 g，川芎10 g，地龍10 g，酒大黃5 g。以上藥物400 g(5付)，加10倍水，煎煮3次，每次0.5 h，煎煮液濃縮至500 ml，生藥濃度為0.8 g/ml。以上均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室制備，4℃保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆弥亟M組織纖溶酶原激活劑(rt-PA，批號(hào)005765201304，德國勃林格殷格翰公司)，血栓誘導(dǎo)劑(批號(hào)20081218，長春國奧藥業(yè)有限公司)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、54型紫外分光光度儀(上海光譜儀器有限公司)、Linegene9620(BIOER)熒光定量PCR儀、Neofuge13R型高速冷凍離心機(jī)(HealForce上海力申科學(xué)儀器有限公司)、TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、WD-9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)、AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、DW-86L628型超低溫保存箱(Haier)。

1.4模型制備取大鼠股動(dòng)脈血3 ml制備3.5～5 mm的自體血栓條5～8塊備用。參照張新江等〔11〕方法制備大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型大鼠。模型組、rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)組大鼠均以上述方法造模。假手術(shù)組手術(shù)注射時(shí)以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液，余過程相同。

1.5動(dòng)物分組與處理方法按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)組。每組40只，各組再分為6 h、1 d、3 d、7 d 4個(gè)時(shí)相〔12〕，每個(gè)時(shí)相各取10只大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。其中rt-PA組、rt-PA+化痰通絡(luò)組在造模成功后予以rt-PA 5.67 mg/kg〔13〕加入0.9% 生理鹽水2 ml中，一次性于20 min內(nèi)由尾靜脈緩慢注入以溶栓治療；rt-PA+化痰通絡(luò)組大鼠在此基礎(chǔ)上每日需予9 ml/kg濃煎劑〔13〕，每日分2次灌胃，每次約0.9～1.4 ml藥液(200～250 g大鼠)，其中6 h取材組于造模成功后給予中藥1次，均采用灌胃方法給藥。假手術(shù)組及模型組于相同時(shí)間點(diǎn)采用與rt-PA相等劑量生理鹽水于溶栓由尾靜脈緩慢注入，并且于灌服中藥相同時(shí)間點(diǎn)，用與中藥相等劑量的蒸餾水進(jìn)行灌胃。

1.6觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.6.1Western印跡法檢測(cè)UPR相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點(diǎn)IRE1、PERK、ATF6和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(GRP78/BiP)蛋白水平各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，并選取梗死部位腦組織勻漿。按照核蛋白和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明抽提組織的總蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加一抗(使用TBS稀釋，濃度為1∶200～1∶1 000)，搖床上孵育2 h，TBST洗膜；加二抗(使用TBS 稀釋，濃度為1∶2 000)，搖床上孵育2 h后，TBST洗膜?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)顯影、定影、洗片，得到圖像結(jié)果后應(yīng)用專業(yè)軟件測(cè)量灰密度值。

1.6.2熒光定量PCR檢測(cè)UPR相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點(diǎn)IRE1、PERK、ATF6基因水平各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，并選取梗死部位腦組織勻漿。按照Trizol試劑盒(Gibco公司)說明提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度。紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度(A)值，A260/A280>1.8，將在0.1 g瓊脂糖凝膠電泳上顯示，證實(shí)含有18 s和28 s兩條帶的標(biāo)本用于反轉(zhuǎn)錄步驟。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25 μl反應(yīng)體系：分別加入MasterMix 12.5 μl、5 μmol/L正義、反義引物各0.25 μl、Template 2.5 μl和Deionized水9.5 μl混勻(正義引物與反義引物分別為IRE1、PERK、ATF6引物序列)。放入熒光定量PCR儀中，條件為95℃、10 min后執(zhí)行95℃，15 s，60℃，1 min，40個(gè)循環(huán)，以觀察熒光定量熔解度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死部位腦組織IRE1蛋白和基因表達(dá)的比較同一組內(nèi)，與6 h相比，模型組7 d時(shí)、rt-PA+化痰通絡(luò)組1 d和7 d時(shí)IRE1蛋白的相對(duì)豐度值明顯降低(P<0.05)，且各組均以6 h相對(duì)豐度值最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在4個(gè)時(shí)相IRE1蛋白相對(duì)豐度值均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組6 h、rt-PA+化痰通絡(luò)組6 h、7 d時(shí)IRE1蛋白的相對(duì)豐度值均明顯增高(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在6 h IRE1蛋白的相對(duì)豐度值明顯增加(P<0.05)，見表1，圖1。同一組內(nèi)，與6 h相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組1 d和3 d時(shí)IRE1 mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，且均以6 h時(shí)為最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在6 h、1 d和3 d時(shí)IRE1 mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組3 d時(shí)和rt-PA+化痰通絡(luò)組6 h、1 d和3 d的IRE1 mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在6 h、1 d和3 d時(shí)IRE1 mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)，見表2。

表1　不同時(shí)相大腦梗死組織IRE1蛋白的

同一組內(nèi)，與6 h相比：1)P<0.05；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比：2)P<0.05；與模型組相比：3)P<0.05；與rt-PA組相比：4)P<0.05；表2同

圖1　不同時(shí)相大腦梗死組織IRE1蛋白的相對(duì)豐度值

表2　不同時(shí)相大腦梗死組織IRE1 mRNA

2.2各組大鼠腦梗死部位腦組織PERK蛋白和基因表達(dá)的比較同一組內(nèi)，與6 h相比，各時(shí)相PERK蛋白的相對(duì)豐度值均無明顯差異(P>0.05)，但均以1 d時(shí)相對(duì)豐度值最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在4個(gè)時(shí)相中PERK蛋白的相對(duì)豐度值明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，僅有rt-PA+化痰通絡(luò)組1 d時(shí)PERK蛋白的相對(duì)豐度值均明顯降低(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在各時(shí)相PERK蛋白的相對(duì)豐度值均無明顯差異(P>0.05)，見表3，圖2。同一組內(nèi)，與6 h相比，模型組、rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)組1 d時(shí)的PERK mRNA表達(dá)量均有明顯差異(P<0.05)，且均以1 d時(shí)為最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在各時(shí)相中PERK mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)組除7 d之外，各時(shí)相的PERK mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在4時(shí)相PERK mRNA表達(dá)量均無明顯差異(P>0.05)，見表4。

2.3各組大鼠腦梗死部位腦組織ATF6蛋白與基因表達(dá)的比較同一組內(nèi)，與6 h相比，各組ATF6蛋白的相對(duì)豐度值均無明顯差異(P>0.05)，但均以1 d時(shí)相對(duì)豐度值最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在4個(gè)時(shí)相中ATF6蛋白的相對(duì)豐度值均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組3 d、rt-PA+化痰通絡(luò)組1、3、7 d時(shí)ATF6蛋白的相對(duì)豐度值均明顯降低(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在7 d時(shí)ATF6蛋白的相對(duì)豐度值有明顯降低(P<0.05)，見表5，圖3。同一組內(nèi)，與6 h相比，模型組、rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)組1 d時(shí)的ATF6 mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)，且均以1 d時(shí)為最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在各時(shí)相中ATF6 mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組1 d、3 d和rt-PA+化痰通絡(luò)組各時(shí)相的ATF6 mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在3 d和7 d時(shí)相ATF6 mRNA表達(dá)量均有明顯降低(P<0.05)，見表6。

表3　不同時(shí)相大腦梗死組織PERK蛋白的

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

圖2　不同時(shí)相大腦梗死組織PERK蛋白的相對(duì)豐度值

表4　不同時(shí)相大腦梗死組織PERK mRNA

同一組內(nèi)，與6 h相比：1)P<0.05；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比：2)P<0.05；與模型組相比：3)P<0.05

表5　不同時(shí)相大腦梗死組織ATF6蛋白的

同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；與rt-PA組相比：3)P<0.05

圖3　不同時(shí)相大腦梗死組織ATF6蛋白的相對(duì)豐度值

組別6h1d3d7d假手術(shù)組0.78±0.082)0.89±0.150.70±0.090.61±0.09模型組1.53±0.052.60±0.201)2)1.58±0.172)1.46±0.102)rt-PA組1.43±0.041.69±0.131)3)1.42±0.173)1.41±0.10rt-PA+化痰通絡(luò)組1.22±0.173)1.61±0.161)3)1.21±0.023)4)1.00±0.143)4)

同一組內(nèi)與6 h相比：1)P<0.05；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比：2)P<0.05；與模型組相比：3)P<0.05；與rt-PA組相比：4)P<0.05

2.4各組大鼠腦梗死部位腦組織BiP蛋白表達(dá)的比較同一組內(nèi)，與6 h相比，各組BiP蛋白的相對(duì)豐度值均無明顯差異，但均以1 d時(shí)相對(duì)豐度值最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律；同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在4個(gè)時(shí)相中BiP蛋白的相對(duì)豐度值均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，rt-PA組除7 d外的各時(shí)相和rt-PA+化痰通絡(luò)組各時(shí)相BiP蛋白的相對(duì)豐度值均明顯增加(P<0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組各時(shí)相BiP蛋白的相對(duì)豐度值無明顯差異(P>0.05)，見表7，圖4。

表7　不同時(shí)相大腦梗死組織BiP蛋白的

同一時(shí)相內(nèi)，與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

圖4　不同時(shí)相大腦梗死組織BiP蛋白的相對(duì)豐度值

3討論

急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷，限制溶栓療法廣泛開展最直接、最主要的原因之一。目前尚無有效干預(yù)手段，而其機(jī)制與ERS密切相關(guān)。UPR，是細(xì)胞進(jìn)化過程中在ERS早期形成了高度保守的自我保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是ERS早期所活化的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔14〕。UPR的激活主要通過3個(gè)不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)：肌醇需要酶1(IRE1)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和轉(zhuǎn)錄活化因子(ATF6)。無應(yīng)激狀態(tài)下，這3種跨膜蛋白分別與GRP78/BiP結(jié)合而處于失活狀態(tài)。但當(dāng)腦缺血再灌注等情況下，引起ERS，錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蓄積可導(dǎo)致GRP78/BiP從三種跨膜蛋白上解離并激活，作為ERS早期的標(biāo)志物大量表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，達(dá)到維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的作用〔14〕。而各跨膜蛋白在感應(yīng)應(yīng)激后，分別將信號(hào)傳遞給下游信號(hào)通路。

IRE1通路的中間產(chǎn)物與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件(ERSE)和未折疊蛋白反應(yīng)元件(UPRE)結(jié)合，通路能促進(jìn)UPR靶分子(如GRP78/BiP和GRP94)的基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)GRP78/BiP和GRP94等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)〔15〕。PERK通路能特異磷酸化真核細(xì)胞蛋白翻譯啟動(dòng)因子eIF2α，快速阻止了新生蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊壓力〔16〕。ATF6是未折疊蛋白的感受器，應(yīng)激時(shí)ATF6被切割成50 kD N端片段，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)含ERSE的轉(zhuǎn)錄因子XBP1和UPR靶分子BiP等基因轉(zhuǎn)錄〔17〕。

本實(shí)驗(yàn)研究考慮化痰通絡(luò)法中藥聯(lián)合rt-PA溶栓治療可能最先影響IRE1的表達(dá)量，進(jìn)而影響其他指標(biāo)發(fā)生變化〔18，19〕。rt-PA溶栓聯(lián)合化痰通絡(luò)方中藥治療急性腦梗死，可能通過增加梗死區(qū)域UPR靶分子IRE1基因和蛋白、BiP基因的表達(dá)，發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)功能，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激而存活，達(dá)到改善疾病預(yù)后的作用。

腦梗死屬祖國醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，風(fēng)痰瘀阻證在缺血性中風(fēng)急性期起病中占絕對(duì)多數(shù)。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“急則治其標(biāo)”的治療原則，早期投以化痰瀉濁、祛瘀通絡(luò)方藥切中病機(jī)。我們?cè)谂R床工作中對(duì)于急性腦梗死風(fēng)痰瘀阻證患者，采用化痰通絡(luò)法聯(lián)合溶栓治療取得了滿意療效〔20，21〕。

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〔2015-10-07修回〕

(編輯李相軍)

Effects of Huatan Tongluo on related factors of unfolded protein response in ERS after thrombolytic therapy in acute cerebral infarction

LIU Shuang, ZHOU Zhen, ZHANG Yu-Lian,et al.

The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Huatan Tongluo therapy on related factors of unfolded protein response in ERS after thrombolytic therapy in acute cerebral infarction and investigate the mechanism of Huatan Tongluo for endoplasmic reticulum homeostasis after acute cerebral infarction after thrombolysis therapy.Methods160 healthy SD rats were randomly divided into 4 groups, sham operation, model, rt-PA and rt-PA combined with Huatan Tongluo groups, 40 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was prepared by autologous blood clots. Rats in rt-PA group and rt-PA combined with Huatan Tongluo groups were treated with rt-PA thrombolytic therapy after thrombosis, rats in rt-PA combined with Huatan Tongluo group were also given 9 ml/kg Huatan Tongluo prescription by gavage, two times a day. The expressions of IRE-1, PERK, ATF6 and GRP78/Bip in rat cortex and hippocampus were detected by Western blot and RT-PCR at 6 h,1 d,3 d and 7 d respectively.ResultsIRE1 gene and protein were the highest expression level in 6 h (P<0.05), PERK, ATF6 gene and protein and Bip protein expression were the highest in 1 d in the same group (P<0.05). At the same time point, compared with the sham operation group, the expressions of above indexes in the model group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, expressions of IRE1 gene and protein, BiP gene were increased (P<0.05), the expressions of PERK, ATF6 gene and protein were decreased in rt-PA and rt-PA+ Huatan Tongluo groups(P<0.05). Compared with rt-PA group, expressions of IRE1 gene and protein, Bip protein were higher, and there were significant differences at 6 h, 1 d, 3 d in rt-PA+ Huatan Tongluo group (P<0.05). There were no significant differences in PERK gene and protein between rt-PA and rt-PA+ Huatan Tongluo groups (P>0.05). Compared with rt-PA group, the expressions of ATF6 gene and protein were lower in rt-PA+ Huatan Tongluo group and there were significant differences at 3 d, 7 d (P<0.05).ConclusionsHuatan Tongluo has protective effects on ischemia reperfusion injury induced by acute cerebral infarction after thrombolysis, which may relate to the regulation of the expression of, the related factors unfolded protein response in ERS such as IRE1 gene and protein, BiP gene and so on.

【Key words】Huatan Tongluo; Ischemia-reperfusion; ERS; Unfolded protein response (UPR)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273942)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃(12JCZDJC25300)

通訊作者：周震(1974-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)內(nèi)科臨床與科研工作。

〔中圖分類號(hào)〕R25

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2052-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.002

1天津中醫(yī)藥大學(xué)

第一作者：劉爽(1984-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦病臨床、科研及教學(xué)工作。