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    一株鴨源新城疫病毒的分離鑒定及F基因序列分析

    2016-06-03 08:33:41忍肖華平范建華
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2016年4期
    關(guān)鍵詞:鴨場(chǎng)進(jìn)化樹核苷酸

    黃 忍肖華平范建華

    (1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,山東濰坊 261000;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,江蘇揚(yáng)州 225125)

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    一株鴨源新城疫病毒的分離鑒定及F基因序列分析

    黃 忍1肖華平1范建華2

    (1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,山東濰坊 261000;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,江蘇揚(yáng)州 225125)

    [摘 要]從山東濰坊某發(fā)病鴨場(chǎng)分離到1株病毒,經(jīng)分離、鑒定為鴨新城疫。對(duì)該分離病毒進(jìn)行了毒力和致病性等生物學(xué)特性分析。結(jié)果,該分離病毒連續(xù)傳3代后,HA效價(jià)穩(wěn)定在9log2以上,MDT為124.5h,ICPI為0.292,F(xiàn)基因核苷酸和轉(zhuǎn)譯氨基酸與傳統(tǒng)Lasota株的同源性最高,與Kuwait256株最低。而F基因裂解位點(diǎn)的氨基酸組成與NDV強(qiáng)毒株的特征性結(jié)構(gòu)一致(“112R-R-Q-K-R-F117”)。結(jié)論:(1)該病例為鴨Ⅰ型新城疫弱毒株感染;(2)F基因的裂解位點(diǎn)的特征性結(jié)構(gòu)不完全決定鴿新城疫的毒力。

    [關(guān)鍵詞]鴨新城疫HA效價(jià)F基因

    鴨新城疫又稱鴨副黏病毒病,是由鴨Ⅰ型副黏病毒引起的,目前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的一個(gè)主要烈性傳染病。發(fā)病鴨多見于青年鴿,以拉綠色糞便、扭頭、翅膀下垂等為主要臨床表現(xiàn)。發(fā)病率可高至20%以上。急性發(fā)病期,如果有其他細(xì)菌性疾病和寄生蟲病伴發(fā),死亡率還會(huì)更高。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)山東濰坊地區(qū)某規(guī)?;唸?chǎng)的發(fā)病情況,及時(shí)采取病死鴿的腦 、脾臟等組織進(jìn)行了病毒分離和鑒定,以及相關(guān)的生物學(xué)特性研究,旨在探明該鴨場(chǎng)發(fā)病原因,為進(jìn)一步治療提供參考和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試驗(yàn)雞和雞胚 SPF雞胚購自山東家禽所,SPF雛雞在中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心孵化、飼養(yǎng)。

    1.1.2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 NDV、AIVH5、H9和EDSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,均購自中國獸藥監(jiān)察所。

    1.1.3試驗(yàn)用菌株和質(zhì)粒 E.coli DH5α和pGEM-T Easy載體均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供。

    1.1.4試驗(yàn)用試劑 RNA提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒IPTG、X-gal、RNA 酶抑制劑、EcoR I和DNA Marker DL2000、氨芐西林和DEPC均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

    1.2方法

    1.2.1病毒分離、噬斑純化 參照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。

    1.2.2血清學(xué)鑒定 用β-半數(shù)微量法測(cè)定尿囊液HA效價(jià),用NDV、H5、H9、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。

    1.2.3病毒毒力測(cè)定 MDT和ICPI測(cè)定:參照《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(SN/T111022002)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

    1.2.4引物設(shè)計(jì)、合成和基因測(cè)序 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的NDV F基因全基因序列,利用primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)了引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,序列為:P1:5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′,P2:5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后測(cè)序。

    1.2.5同源性比較和進(jìn)化樹分析 利用MEGA4.0軟件對(duì)所測(cè)序列和GenBank上已公布的NDV毒株序列進(jìn)行比較,根據(jù)F基因ORF 1-389nt之間的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹和基因分型,并分析裂解位點(diǎn)的氨基酸組成。

    2 結(jié)果

    2.1病毒分離、純化結(jié)果

    病毒接種SPF雞胚,48 h以后全部出現(xiàn)死亡,死亡雞胚胚體均表現(xiàn)彌漫性出血,尤以胚的頭部、肝臟和腎臟出血嚴(yán)重;病毒前2代細(xì)胞噬斑出現(xiàn)時(shí)間、大小不一,到第3代以后噬斑出現(xiàn)時(shí)間是48 h以內(nèi),大小較均勻。

    2.2血清學(xué)鑒定結(jié)果

    病毒連續(xù)傳至第3代以后,HA效價(jià)穩(wěn)定在9log2以上;HI試驗(yàn)表明,該分離病毒的紅細(xì)胞凝集性可被NDV抗血清抑制,AIVH5、AIVH9及EDS-76陽性血清表現(xiàn)陰性,初步鑒定為新城疫病毒感染。

    2.3病毒毒力測(cè)定結(jié)果

    2.3.1MDT測(cè)定結(jié)果 取10-6~10-9稀釋度分離、純化的病毒,每個(gè)稀釋度接種5只10日齡SPF雞胚,0.1 ml/只,照蛋3次/d,間隔8 h,共觀察7 d,記錄雞胚死亡時(shí)間,結(jié)果(見表1)表明,引起雞胚死亡的最高稀釋度(MLD)在10-7,計(jì)算得MDT為124.5h。

    表1 SPF 雞胚接毒后死亡情況

    2.3.2ICPI測(cè)定結(jié)果 取1日齡雛雞10只,各腦內(nèi)注射10-1稀釋度的純化尿囊液0.05 ml。另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.05 ml。接種后,每天在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察,記錄雛雞的情況,分正常(活動(dòng)靈活,行動(dòng)無共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象)、發(fā)?。ò楸?、臥地不起,但不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞)和死亡。觀察8 d(結(jié)果見表2),計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù),根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0、發(fā)病為1,死亡為2),累計(jì)總分?jǐn)?shù),計(jì)算得ICPI為0.292。

    2.4F基因測(cè)序結(jié)果

    經(jīng)一步法RT-PCR,獲得1條約480bp的特異性擴(kuò)增條帶,與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相符(見圖1)。應(yīng)用MEGA4.0軟件分析測(cè)序結(jié)果,推導(dǎo)其氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)該毒株F基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117,與NDV強(qiáng)毒株的特征性結(jié)構(gòu)相符。

    表2 1日齡SPF雞腦內(nèi)接種后發(fā)病情況

    圖1 NDV F 基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.5同源性分析結(jié)果

    應(yīng)用MEGA4.0軟件,將W1株與GenBank中已公布的具有代表性的NDV毒株F基因ORF 1-389nt之間核苷酸進(jìn)行同源性比較分析,結(jié)果見表3。其中,與Lasota株的同源性最高,核苷酸序列同源性達(dá)99.9%,轉(zhuǎn)譯氨基酸的同源性達(dá)100%;與Kuwait 256株的同源性最低,核苷酸序列同源性達(dá)80.5%,轉(zhuǎn)譯氨基酸的同源性達(dá)82.7%。

    2.6系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

    根據(jù)F基因ORF的1-389bp序列,應(yīng)用MEGA4.0軟件對(duì)GenBank中已公布的NDV毒株與本實(shí)驗(yàn)分離毒株的F基因進(jìn)行序列比對(duì)分析,繪制了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(見圖2)。本實(shí)驗(yàn)分離株在分類地位上屬于基因I型。

    表3 W1株與已公布的NDV代表株F基因核苷酸和氨基酸的同源性比較(%)

    圖2 NDV F基因片段(389bp)遺傳進(jìn)化樹(注:本實(shí)驗(yàn)中的分離株用▲標(biāo)出)

    3 討論與分析

    (1)鴨新城疫是鴨子常見的病毒性疾病之一,主要發(fā)病鴨為青年鴨,產(chǎn)蛋種鴨后期也偶有發(fā)生。近年來,在我國內(nèi)陸多個(gè)城市的鴨場(chǎng)都有病例報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究中的鴨新城疫病毒正是從山東濰坊某規(guī)模化種鴨場(chǎng)分離到的。該鴨場(chǎng)有15棚青年鴨,然而自發(fā)病以來,發(fā)病率和死亡率急劇上升。筆者結(jié)合常規(guī)血清學(xué)方法和分子生物學(xué)手段確診該病例為鴨新城疫弱毒株感染,從分類地位上屬于基因型I型,從核苷酸和轉(zhuǎn)譯氨基酸組成來看與傳統(tǒng)Lasota株的同源性最高,與Kuwait 256株同源性最低,這可能與該分離病毒的始源和傳代次數(shù)有關(guān)。但從MDT和ICPI的測(cè)定數(shù)據(jù),以及F基因序列特征結(jié)構(gòu)等來看,不能確定為是Lasota疫苗株的變異,這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一。

    (2)自新城疫首次發(fā)生以來,有關(guān)新城疫的毒力與F基因或HN基因序列特征結(jié)構(gòu)的相關(guān)性報(bào)道很多,爭(zhēng)議也很大。Collins[1]等人從鴿子上分離到一株新城疫病毒,并開展了生物學(xué)特性研究,認(rèn)為新城疫的毒力和致病性與F基因序列特征結(jié)構(gòu)相關(guān),然而Pearson[2]等從鴿分離的10株新城疫病毒進(jìn)行毒力型測(cè)定時(shí),發(fā)現(xiàn)這10株鴿分離物至少相當(dāng)于雞新城疫中的中發(fā)型毒株,但其最小致死量致死雞胚的平均死亡時(shí)間(MDT)最低值為98h,與雞的中發(fā)型毒株的MDT小于90h又表現(xiàn)出不一致,而且這幾株分離物通過泄殖腔、鼻腔或肌肉注射時(shí)不使雞發(fā)??;范建華[8]等也發(fā)現(xiàn)鴿新城疫的毒力與F基因序列無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)分離到的一株鴨新城疫,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定,MDT〉90h,ICPI 〈0.5,符合弱毒株的特征性結(jié)構(gòu),而F基因轉(zhuǎn)譯氨基酸的組成(112R-R-Q-K-R-F117)又符合強(qiáng)毒株特征。因此,新城疫的毒力和致病性不能完全由新城疫的F基因裂解位點(diǎn)的特征性結(jié)構(gòu)決定。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Collins M S.Strong I.Alexander D J.Pathogenichy and phytegenetie evaluation of the varian Newcastle disease viruses termed“pigeon PMV-l Viruses”based on the nucleofide sequence of the fusion protein gene[J].Arch Viro1,1996,(14l):635-647.

    [2] Pearson J E,Senne D A,Alexandex D J,et a1.Characterization of Newcastle disease virus isolated from pigeons [J].Avian Dis,1987,(31):105-111.

    [3] Werner O,Romer-Oberdorfer A,Kollner B,et a1.Characterization of avian paramyxovirus type I strains isolated in Germany during 1982 to 1986[J].Avian Pathology,1999,(28):79.

    [4] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)(第2版)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

    [5] 孫淑紅,崔治中.雞胚中新城疫強(qiáng)毒的分離、鑒定與生物學(xué)特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,38(7):741-743.

    [6] 劉華雷,蔣小剛,張維,等.一株Class I新城疫病毒中國分離株分子特性的研究[J].中國動(dòng)物檢疫,2009,25(8):30-33.

    [7] 孫杰,刁有祥,李建俠,等.10株鴨源新城疫病毒的分離鑒定及F基因遺傳進(jìn)化分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,41(8):1054-1060.

    [8] 范建華,劉華雷,劉學(xué)賢,徐步,等.一株鴿新城疫病毒的分離鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2011,27(6):44-47.

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