BDNF與腦缺血嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安 710004)

鄭少微　展淑琴▲　張凌峰　高亞亞　鞏付華　吳海琴　張桂蓮　范清雨　翟躍芬

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BDNF與腦缺血嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安 710004)

鄭少微展淑琴▲張凌峰高亞亞鞏付華吳海琴張桂蓮范清雨翟躍芬

摘要目的：研究腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與腦缺血嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法：制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，于30 min MCAO及100 min MCAO后再灌注4 h、8 h、24 h后取大鼠腦組織進(jìn)行BDNF免疫組織化學(xué)染色，觀察缺血腦皮層內(nèi)BDNF陽性細(xì)胞所占比例，并與假手術(shù)對(duì)照組比較。結(jié)果：30 min MCAO組再灌注4 h、8 h、24 h與假手術(shù)對(duì)照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細(xì)胞所占比例無明顯差異(P>0.05)；100 min MCAO再灌注4 h、8 h、24 h組與假手術(shù)對(duì)照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細(xì)胞所占比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：腦組織缺血可導(dǎo)致缺血神經(jīng)元BDNF表達(dá)明顯增加。

主題詞腦缺血梗塞，大腦中動(dòng)脈腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子免疫組織化學(xué)

在我國腦卒中做為常見疾病，具有高病死率、高致殘率，因此，關(guān)于腦卒中的預(yù)防與治療成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是腦細(xì)胞生成和分泌的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有提高神經(jīng)元存活、分化及再生的作用，與學(xué)習(xí)、記憶方面的突觸可塑性密切相關(guān)[1-5]，而且BDNF與心境障礙、精神分裂等精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6-8]。在動(dòng)物腦缺血模型中，BDNF表現(xiàn)出明顯的腦保護(hù)作用[9]。本文通過大鼠腦缺血模型中BDNF的表達(dá)情況，探討B(tài)DNF與腦缺血嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，為治療缺血性腦血管病提供新的理論指導(dǎo)。

材料與方法

1材料健康成年雄性SD大鼠100 只，體重250～300 g，8周齡左右，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗BDNF及免疫組化試劑購自武漢博士德。尼龍線頭端經(jīng)特殊燒制而成，線栓長度為35 mm，光滑并大小一致，在20 mm處做標(biāo)記，以便測量進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈的長度，線栓經(jīng)酒精消毒后備用。試驗(yàn)器械及試劑主要有：酒精棉球，碘伏，棉簽，眼科剪，眼科鑷，動(dòng)脈夾，自制拉鉤，4-0手術(shù)線，生理鹽水，10%水合氯醛，4%多聚甲醛，25%及30% 蔗糖溶液，冰凍組織切片機(jī)。

2方法①大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型：用線栓法建立大鼠MCAO模型[10]。將100只大鼠隨機(jī)分為MCAO組80只，對(duì)照組20只，其中30 min MCAO亞組40只，100 min MCAO亞組40只，對(duì)應(yīng)30 min假手術(shù)亞組10只，100 min假手術(shù)亞組10只。10%水合氯醛按0.35 ml/100g經(jīng)腹腔注射，5～8 min麻醉完全，肌肉松弛后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪去頸前區(qū)毛發(fā)，消毒手術(shù)區(qū)皮膚；沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織， 用自制拉鉤分別向兩邊牽引胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌，完全暴露頸總動(dòng)脈(CCA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，頸外動(dòng)脈(ECA)；游離血管后，在距ECA 和 ICA 分叉0.5 cm 處結(jié)扎CCA，結(jié)扎 ECA，動(dòng)脈夾夾閉 ICA；用眼科剪在 CCA近ICA處剪一小口，將線栓插入ICA，松開動(dòng)脈夾，將線栓繼續(xù)向前推進(jìn)，直到感到阻力后停止，測量進(jìn)入ICA的線栓長度，距分叉處約18～19 mm，結(jié)扎ICA止血，固定線栓；插入線栓開始計(jì)時(shí)，分別在30 min，100 min后拔出線栓，大腦中動(dòng)脈供血區(qū)可得到前交通動(dòng)脈、后交通動(dòng)脈的血供形成再灌注，在再灌注4h、8h、24h 后經(jīng)心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛(0.1M，pH 7.4)后取腦，4℃分別置于4% 多聚甲醛、25%及30% 蔗糖溶液沉底后行冠狀凍切，片厚12 μm，-80℃保存。對(duì)照組不行線拴及動(dòng)脈結(jié)扎，余同MCAO 組。②BDNF免疫組織化學(xué)染色：室溫晾干切片后經(jīng)4%多聚甲醛固定及3% H2O2、5%BSA處理后加一抗(1:200)4 ℃過夜，用生物素化羊抗兔IgG于37 ℃孵育20 min后滴加SABC試劑，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。③計(jì)數(shù)：每張BDNF免疫組化切片上隨機(jī)選擇5個(gè)200×的視野，人工計(jì)數(shù)每張視野中BDNF陽性細(xì)胞(胞漿染色棕色)占所有帶核細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。動(dòng)物試驗(yàn)中，計(jì)算各個(gè)組的各個(gè)時(shí)間段BDNF陽性細(xì)胞所占比例，采用獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)計(jì)算，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

BDNF陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。30 min MCAO組再灌注4 h、8 h、24 h，與30 min假手術(shù)對(duì)照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細(xì)胞所占比例無明顯差異(P>0.05)(表1)；而100 min MCAO組與100 min假手術(shù)對(duì)照組比較，可見再灌注4 h、8 h、24 h時(shí)缺血腦皮層BDNF陽性細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)(表2)，尤其在8 h增加為著。

表1　30 min MCAO再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠

表2　100 min MCAO再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

討論

缺血缺氧導(dǎo)致的腦神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致腦梗死后病人運(yùn)動(dòng)、感覺等功能難以恢復(fù)的主要原因，減少腦梗死患者腦神經(jīng)元的凋亡或者促進(jìn)其重生可以極大的改善腦梗死患者預(yù)后。目前動(dòng)物研究表明BDNF具有抗神經(jīng)元凋亡及刺激神經(jīng)元再生，從而改善腦缺血預(yù)后的作用[11]。大鼠腦梗死后靜脈注射BDNF，其可通過血腦屏障到達(dá)缺血部位發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡、刺激神經(jīng)元重生的作用，提高腦梗死后運(yùn)動(dòng)及感覺功能的能恢復(fù)[12]。一項(xiàng)長達(dá)10年的臨床隨訪試驗(yàn)結(jié)果表明低濃度BDNF水平是增加中風(fēng)事件的危險(xiǎn)因素，而高濃度BDNF水平表現(xiàn)出少的腦白質(zhì)缺血及好的視覺記憶[13]。BDNF還可做為評(píng)價(jià)老年女性記憶及一般認(rèn)知功能損害程度的生物學(xué)標(biāo)志物[14]。本文通過動(dòng)物試驗(yàn)，表明在腦組織缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損害時(shí)BDNF表達(dá)明顯增加。

動(dòng)物試驗(yàn)中，30 min MCAO組較假手術(shù)組BDNF陽性細(xì)胞比例無明顯增加，而100 min MCAO組中BDNF陽性細(xì)胞明顯增加并且細(xì)胞胞漿染色明顯增濃，在再灌注8h增加尤其明顯。這表明神經(jīng)元損傷越是嚴(yán)重，BDNF的表達(dá)越高，而且在最初幾小時(shí)BDNF表達(dá)緩慢增加，而之后出現(xiàn)BDNF表達(dá)快速增加。根據(jù)目前研究表明BDNF是腦神經(jīng)元含量較多的神經(jīng)肽，參與神經(jīng)元發(fā)育、分化、生長以及學(xué)習(xí)與記憶，同時(shí)本試驗(yàn)說明BDNF也參與腦缺血再灌注損傷。在腦組織損傷數(shù)小時(shí)內(nèi)，BDNF高表達(dá)參與機(jī)體抗凋亡機(jī)制，減輕神經(jīng)元損傷程度，有利于改善腦卒中預(yù)后，但BDNF參與神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制還不清楚。BDNF對(duì)酪氨酸激酶受體B(tyrosin-kinase receptor B，TrkB)高親和，而TrkB廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜。脊髓損傷后通過鞘內(nèi)注射或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或干細(xì)胞移植使脊髓內(nèi)BDNF表達(dá)增多，明顯提高神經(jīng)元及軸突的成活，而使用TrkB受體抑制劑或其表達(dá)阻滯，神經(jīng)元恢復(fù)明顯受抑制[15]。BDNF結(jié)合全長型TrkB，使TrkB受體二聚體化，胞漿內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化和胞內(nèi)段的酪氨酸激酶區(qū)域活化，可以激活下游的分裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和磷脂酶c(PLC-γ)等信號(hào)通路，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長、分化、再生等生理作用[16]。BDNF的神經(jīng)元保護(hù)作用是其研究一大熱點(diǎn)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。雖然BDNF具有腦保護(hù)作用，但嚴(yán)重腦缺血事件導(dǎo)致被損害組織在24 h內(nèi)BDNF高表達(dá)，即刻的外源途徑增加BDNF濃度來治療腦卒中疾病是否必要，這個(gè)值得我們思考。

本研究表明腦缺血性損傷可以使BDNF表達(dá)增加。目前，BDNF的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及刺激神經(jīng)元再生的機(jī)制還不是很清楚。希望本研究可以拋磚引玉，有待今后的大規(guī)模臨床試驗(yàn)印證BDNF的腦保護(hù)作用及其作用機(jī)制。當(dāng)下腦梗死沒有特效藥物治療的情況下，新型藥物的研究和研發(fā)成為今后的一大熱點(diǎn)。希望本試驗(yàn)?zāi)転槟X梗死的治療提供新的理論指導(dǎo)。

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(收稿：2015-05-05)

The Relationship between BDNF and the severity of cerebral ischemia

The Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an

Jiaotong University(Xi’an 710004 )Zheng ShaoweiZhan ShuqinZhang Lingfenget al

ABSTRACTObjective：To discuss the relationship between BDNF and the severity of cerebral ischemia.Methods：The models of rats middle cerebral artery occlusion (MCAO) were made and the rats’ brains were gotten at 4 h、8 h and 24 h reperfusion after 30 minutes MCAO and 100 minutes MCAO respectively. The proportion of BDNF positive cells in ischemic rats cortices were analysised by immunohistochemical staining and compared with those of sham groups.Results：There were no significant differences(P>0.05)in the proportions of BDNF positive cells at 4 h，8 h and 24 h reperfusion after 30 minutes MCAO compared with those of the sham group. However，the proportions of BDNF positive cells at 4 h， 8 h and 24 h reperfusion after 100 minutes MCAO were higher compared with those in the corresponding sham group (P<0.05). Conclusion：The expression of BDNF significantly increased in ischemia neurons.

KEY WORDSCerebral ischemiaInfarction，middle cerebral arteryBrain-derived neurotrophic factorImmunohistochemical

【中圖分類號(hào)】R743.32

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.013

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070999)

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(xjj2014153，2009-95)

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)專項(xiàng)科研基金科技骨干

項(xiàng)目[RC (GG)201109]

▲通訊作者