缺血再灌注損傷對肝細胞癌組織中HIF-1及VEGF表達的影響

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科(西安710077)　李武軍　于　良　張　梅▲

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缺血再灌注損傷對肝細胞癌組織中HIF-1及VEGF表達的影響

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科(西安710077)李武軍于良△張梅△▲

摘要目的：探討缺血再灌注損傷對于肝細胞癌組織中HIF-1及VEGF表達的影響。方法：回顧分析40例肝細胞癌患者的臨床資料，根據(jù)術(shù)中是否阻斷全肝血流，分為缺血再灌注組(n=20)及非缺血再灌注組(n=20)。免疫組化法及Western blot 法檢測肝癌組織中HIF-1和VEGF 蛋白表達的改變。結(jié)果：與非缺血再灌注組相比，缺血再灌注組肝癌組織中HIF-1和VEGF的表達均顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：缺血再灌注可能通過上調(diào)肝癌組織HIF-1 和VEGF 的表達影響患者預(yù)后，在臨床工作中應(yīng)通過術(shù)前準確評估，精準肝切除等操作，盡量避免肝門阻斷，提高患者術(shù)后生活質(zhì)量。

主題詞癌，肝細胞 再灌注損傷缺氧誘導(dǎo)因子1血管內(nèi)皮生長因子

肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴重影響患者的長期預(yù)后。人類的缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是一種螺旋-環(huán)-螺旋狀的蛋白，它的含量受人體組織總氧含量的調(diào)節(jié)，即當組織中的氧含量低于正常值時誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子降解的途徑受到抑制，從而使細胞及組織中HIF-1的含量升高，而當組織中的含氧量處于正常水平時則轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的HIF-1通過泛素途徑進行蛋白的降解。研究表明HIF-1能夠調(diào)節(jié)很多基因的表達，且這些基因參與到了血管的生成和代謝反應(yīng)中。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是高度保守的同源二聚體糖蛋白，受HIF-1的調(diào)節(jié)，可在體內(nèi)促進新血管的生成，從而使內(nèi)皮細胞得以存活、增殖和遷移，同時增加血管的滲透性，促進了各種病程的發(fā)展。本研究的目的在于探討缺血再灌注損傷對于肝細胞癌組織中HIF-1及VEGF表達的影響，從而為減少因手術(shù)因素造成的腫瘤復(fù)發(fā)，提高患者預(yù)后提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1一般資料回顧分析西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2013年1～12月收治的沒有遠處轉(zhuǎn)移的肝細胞癌患者40例，術(shù)前均未接受過放療、化療以及其他抗腫瘤治療，其中男29例，女11例，年齡27～72歲，平均43.1±11.2歲，腫瘤直徑：<5 cm 9例，5～10 cm 21例，>10 cm 10例。根據(jù)術(shù)中未阻斷肝臟血流及間斷阻斷全肝血流(每次阻斷<15 min，術(shù)中總?cè)毖獣r間<30 min)，分為缺血再灌注組(n=20)及非缺血再灌注組(n=20)。

2主要試劑兔抗人HIF-1單克隆抗體工作濃度1∶50，兔抗人VEGF 單克隆抗體工作濃度為1∶50，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3檢測方法免疫組織化學(xué)SP染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，檢測HIF-1及VEGF蛋白在肝細胞癌石蠟切片中的表達。陽性對照采用已知陽性對照片，PBS 代替一抗作空白對照。Western blot 法：使用蛋白提取試劑盒提取肝細胞癌組織中總蛋白，采用Braford 法測定蛋白質(zhì)濃度，使用特異性HIF-1及VEGF抗體免疫印跡檢測，增強化學(xué)發(fā)光法( ECL) 顯影。

4結(jié)果判定免疫組織化學(xué)：陽性HIF-1及VEGF蛋白免疫組織化學(xué)染色主要位于細胞漿，呈棕黃色顆粒，在高倍鏡下(400×) 隨機觀察5個視野計數(shù)陽性細胞，陽性細胞數(shù)<10%記為陰性病例，陽性細胞數(shù)≥10% 為陽性病例，并采用HPIAS21000 型圖文分析系統(tǒng)測量平均光度。Western blot 法：結(jié)果經(jīng)英國UV P公司GDS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)分析處理數(shù)據(jù)。

5統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 11. 0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1HIF-1及VEGF的免疫組化表達情況見附表。HIF-1主要表達在肝癌細胞的胞漿中，且陽性信號強，少數(shù)細胞核中有表達。HIF-1在缺血再灌注肝癌中的陽性表達率為75%(15/20)，非缺血再灌注肝癌中的陽性表達率為20%(4/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGF主要表達在肝癌細胞的胞漿中，在缺血再灌注肝癌中的陽性表達率為70%(14/20)，非缺血再灌注肝癌中的陽性表達率為25%(5/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

附表　HIF-1、VEGF在缺血再灌注和非缺血

2HIF-1及VEGF的Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測結(jié)果顯示，缺血再灌注肝癌組織中HIF-1及VEGF的表達水平較非缺血再灌注肝癌組織明顯升高(圖1，2)，對灰度值統(tǒng)計分析表明兩者之間具有顯著差異(P<0.05) (圖3)。圖1中各實驗組內(nèi)參β-actin的表達水平保持一致，可保證各組總蛋白量相等。

圖1　HIF-1在缺血再灌注和非缺血

圖2　VEGF在缺血再灌注和非缺血

圖3　HIF-1及VEGF在缺血再灌注

討論

缺血再灌注損傷可能引起代謝性或結(jié)構(gòu)性肝損傷，而這一點已經(jīng)成為外科肝臟手術(shù)的一個重要臨床問題。對于原發(fā)性肝癌特別是巨大腫瘤， 傳統(tǒng)手術(shù)操作尤其是肝門阻斷，可能是導(dǎo)致門靜脈系統(tǒng)播散的一個重要途徑[1]， 特別是術(shù)后早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)播散可能說明這一點。但是， 外科操作作為一個危險因素對術(shù)后復(fù)發(fā)的精確意義仍未評估清楚。肝門阻斷可導(dǎo)致肝臟缺血缺氧，而缺氧是腫瘤細胞生長、凋亡、轉(zhuǎn)移等的主要動力之一。目前已證實絕大多數(shù)實體腫瘤的氧分壓低于正常組織。HIF-1蛋白在常氧時很快被細胞內(nèi)氧依賴性泛素-蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下才可穩(wěn)定表達，誘導(dǎo)其靶基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)機體對缺氧環(huán)境的適應(yīng)。在缺氧條件下，HIF-1可以大量激活血管生成因子基因的表達，且與腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，在乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中的研究中均發(fā)現(xiàn)其高表達常提示預(yù)后不良[2-3]。并且發(fā)現(xiàn)HIF-1的高表達與腫瘤組織微血管密度增加密切相關(guān)，其中以調(diào)控血管內(nèi)皮因子(VEGF)最為重要，能夠參與誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成，促進腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移[4]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注癌組織和非缺血再灌注癌組織中HIF-1的陽性率分別為75%和20%，同時在缺血再灌注癌組織和非缺血再灌注癌組織中VEGF的陽性率分別為70%和25%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明，在肝臟腫瘤組織中，手術(shù)過程中的缺血再灌注損傷，引發(fā)了一系列機制，誘導(dǎo)了HIF-1、VEGF的表達。體外研究表明，HIF-1/VEGF途徑和肝臟腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]，因此我們推測，缺血再灌注可能通過上調(diào)腫瘤組織HIF-1和VEGF的表達，增加患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的可能性，在臨床工作中，應(yīng)通過術(shù)前準確評估，精準肝切除等操作，盡量避免肝門阻斷，有可能提高患者術(shù)后生存率。當然，該假設(shè)還需要設(shè)計嚴謹?shù)呐R床試驗驗證。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注能夠上調(diào)肝癌組織HIF-1 和VEGF 的表達，但其對患者預(yù)后的影響及其作用的詳細細胞機制，尚需進一步實驗研究。

參考文獻

[1]Shirabe K，Kajiyama K，Harimoto N，etal.Prognosis of hepatocellular carcinoma accompanied by microscopic portal vein invasion[J].World J Gastroenterol，2009，15：2632-2637.

[2]Li J，Zhang C，Jiang H，etal.Andrographolide inhibits hypoxia-inducible factor-1 through phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway and suppresses breast cancer growth[J].Onco Targets Ther，2015，13：427-35.

[3]Yoysungnoen B， Bhattarakosol P， Patumraj S，etal.Effects of tetrahydrocurcumin on hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor expression in cervical cancer cell-induced angiogenesis in nude mice[J].Biomed Res Int，2015，39：1748.

[4]Wan L， Huang J，Chen J，etal.Expression and significance of FOXP1， HIF-1a and VEGF in renal clear cell carcinoma[J].J BUON，2015，20(1)：188-195.

[5]Xu M， Zheng YL， Xie XY，etal.Sorafenib blocks the HIF-1α/VEGFA pathway， inhibits tumor invasion， and induces apoptosis in hepatoma cells[J].DNA Cell Biol，2014，33(5)：275-281.

(收稿：2015-03-30)

Effects of ischemia and reperfusion injury on HIF-1 and VEGF expression in hepatocellular carcinoma

Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University

(Xi’an 710077)Li WujunYu LiangZhang Mei

ABSTRACTObjective：To discuss the effects of ischemia and reperfusion injury on HIF-1 and VEGF expression in hepatocellular carcinoma. Methods：Immunohistochemistry and Western blot were performed to examine the expressions of HIF-1 and VEGF in 40 human hepatocellular carcinoma tissues. The patients were divided into two groups: ischemia and reperfusion group (n=20) and non- ischemia and reperfusion group (n=20). Results：The expressions of HIF-1 and VEGF in ischemia and reperfusion group increased obviously compared to non-ischemia and reperfusion group(P<0.05). Conclusion：Ischemia and reperfusion injury might affect the prognosis of the hepatocellular carcinoma patients by up-regulating the expressions of HIF-1 and VEGF. In clinical work， doctors should avoid hepatic portal occlusion to improve the prognosis of the patients.

KEY WORDSCarcinoma，hepatocellularReperfusion injuryHypoxia-inducible factor 1Vascular endothelial growth factors

【中圖分類號】R735.7

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.012

△西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院

▲通訊作者