紅景天苷上調(diào)HIF-1信號途徑并減輕腦缺血再灌注損傷的研究

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院麻醉科(西安710054)　王　軍　曹　艷　?！〗?/p>

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紅景天苷上調(diào)HIF-1信號途徑并減輕腦缺血再灌注損傷的研究

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院麻醉科(西安710054)王軍曹艷常江

摘要目的：探討紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組、正常對照+紅景天苷組、腦缺血再灌注組、腦缺血再灌注+紅景天苷組。紅景天苷處理組運(yùn)用紅景天苷(40 mg/kg)處理2周，腦缺血再灌注采用局灶性腦缺血1 h，隨后再灌注24 h處理，隨后取腦，測定腦缺血體積、檢測MDA和8-OHdG等應(yīng)激產(chǎn)物，提取mRNA用于定量RT-PCR測定基因表達(dá)水平變化。結(jié)果：正常對照+紅景天苷組大鼠的腦組織中HIF-1a、乳酸脫氫酶(LDH)和己糖激酶(HK)等表達(dá)水平顯著升高。腦缺血再灌注可誘導(dǎo)HIF-1a、LDH和HK的表達(dá)，紅景天苷處理組行腦缺血再灌注后HIF-1a、LDH、HK升高程度較腦缺血再灌注組顯著減弱。結(jié)論：紅景天苷處理可誘導(dǎo)腦組織中HIF-1的表達(dá)，增加糖酵解酶的水平，加強(qiáng)腦組織對缺血再灌注損傷的抵抗。

主題詞腦再灌注損傷紅景天苷缺氧誘導(dǎo)因子1乳酸脫氫酶類己糖激酶

腦缺血再灌注損傷是臨床腦缺血病治療中的一個(gè)難題，其主要病因是缺血再灌注之后發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)損傷。預(yù)防腦缺血再灌注的藥物研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其中，紅景天因其抗高原缺氧的療效而備受關(guān)注。紅景天是多年生草本植物，其主要成分紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、消除自由基等多種藥理作用[1]。有報(bào)道指出，紅景天苷對心臟和大腦等器官的缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[2]。紅景天苷上述作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是低氧刺激表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵分子，可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)多個(gè)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，紅景天苷可誘導(dǎo)HIF-1的表達(dá)，并減少缺氧所致心肌細(xì)胞凋亡[3]。本研究在大鼠整體動物水平觀察了紅景天苷調(diào)節(jié)腦組織HIF-1表達(dá)的作用，并在缺血再灌注模型動物觀察了紅景天苷抗缺血再灌注損傷的作用，進(jìn)而加深了對紅景天苷抗腦缺血再灌注的作用和分子機(jī)制的認(rèn)識。

材料和方法

1材料80只健康成年雄性SD大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。HIF-1、乳酸脫氫酶(LDH)、己糖激酶(HK)的引物由Life Technologies公司合成。實(shí)驗(yàn)常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2動物分組和處理動物隨機(jī)分為正常對照組(C組)、正常+紅景天苷組(S組)、缺血再灌注組(IR組)，缺血再灌注+紅景天苷組(IR+S組)，每組20只。S組靜脈注射紅景天苷[40 mg/(kg·d)]，給藥14 d。IR+S組在注射紅景天苷[40 mg/(kg·d)]14 d后行腦缺血再灌注。IR組注射生理鹽水作為對照14 d后行腦缺血再灌注。腦缺血再灌注大鼠模型制備參照Longa等方法[4]。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，仰臥固定，頸正中切口分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，在頸外動脈分叉處結(jié)扎頸總動脈，近心端結(jié)扎頸外動脈，頸內(nèi)與頸外動脈交叉處剪一小口，插入處理后的尼龍線，遇阻力停止，1 h后拔出尼龍線，進(jìn)行再灌注。隨后縫合手術(shù)切口，待大鼠麻醉清醒后單籠喂養(yǎng)，24 h后進(jìn)行檢測。

3腦梗死體積測定每組取出6只大鼠，麻醉后迅速取腦，冰鹽水冷卻后，1 mm厚度連續(xù)做腦組織冠狀切片，放入2%TTC溶液中于37℃孵育30 min，再用10%甲醛固定，隨后組織切片照相，用圖像分析軟件計(jì)算梗死面積，各片的梗死面積之和乘以腦片厚度，得出腦梗死體積。

4氧化應(yīng)激檢測每組6只大鼠麻醉后，迅速取腦，選取腦梗死區(qū)域組織，制備腦組織勻漿，勻漿液經(jīng)低溫離心后取上清用于丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平檢測。MDA和8-OHdG檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行，操作步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。上清中蛋白水平采用BCA蛋白定量方法進(jìn)行。

5基因表達(dá)檢測每組8只大鼠麻醉后，迅速取腦，選取腦梗死區(qū)域組織，用RNA提取試劑盒提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后應(yīng)用定量PCR方法進(jìn)行檢測。所用引物的序列如下：HIF-1a的上游引物是5’-ACA GTT ACA GGA TTC CAG CAG AC-3’，下游引物是5’-GAT TCA TCA GTG GTG GCA GTT G-3’。LDH的上游引物是5’-GCA GCA GGG TTT CTA TGG AG-3’，下游引物是5’-TGG AGA CAG TGG GAT TGT CA-3’。HK的上游引物是5’-CAT GAG GAA GAT GCT TGC CG-3’，下游引物是5’-CTA CCA GCA CTC TGC TTG CC-3’。 內(nèi)對照18S的上游引物是5’-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3’，下游引物是5’-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3’。 采用Delta-delta Ct法對基因表達(dá)水平差異進(jìn)行分析。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。方差分析對各組間差異性進(jìn)行比較，以P<0.05為有顯著性差異。

結(jié)果

1紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的減輕作用見表1。C組和S組大鼠未見明顯腦梗死，與之相比，IR組和IR+S組大鼠在腦缺血再灌注后均出現(xiàn)程度的腦梗死，梗死體積在IR+S組較IR組顯著減小(P<0.01)。腦組織MDA和8-OHdG檢測結(jié)果顯示，IR組和IR+S組的大鼠的腦組織中MDA和8-OHdG水平均較C組和S組顯著升高(P<0.01)。與IR組相比，IR+S組大鼠腦組織中MDA和8-OHdG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1　紅景天苷對大鼠腦梗死體積、腦組織

注：與 C組和S組比較，aP<0.01；與IR組比較bP<0.05

2紅景天苷對大鼠腦組織HIF-1、LDH和己糖激酶的表達(dá)檢測見表2。與C組相比，S組中HIF-1、LDH和己糖激酶的基因逼到顯著升高(P<0.01，n=8)。IR組大鼠的腦組織中HIF-1、LDH和己糖激酶的表達(dá)較C組也顯著提高(P<0.05，n=8)。IR+S組大鼠腦組織中HIF-1、LDH和己糖激酶的表達(dá)較S組升高(P<0.05，n=8)，但是其升高程度較IR組無顯著性差異。

表2　紅景天苷對大鼠腦組織中HIF-1a、

注：與 C組和S組比較，*P<0.01；與IR組比較△P<0.05

討論

本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷處理后神經(jīng)功能損傷的積分下降，腦梗死體積減小，表明紅景天苷可減輕腦缺血再灌注損傷。宋斌等[5]報(bào)道紅景天苷減輕心臟的缺血再灌注損傷，其中抗氧化應(yīng)激可能是其保護(hù)作用的一個(gè)原因。陳秀娟等[6]也觀察到紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用。本研究則進(jìn)一步說明紅景天苷可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，并指出紅景天苷的作用與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

MDA和8-OHdG分別是脂質(zhì)過氧化和 DNA氧化損傷的標(biāo)記物，其水平可反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度。MDA和8-OHdG升高表明缺血再灌注誘導(dǎo)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠腦組織中MDA和8-OHdG升高，這與以往報(bào)道腦缺血再灌注損傷伴有顯著的氧化應(yīng)激相一致[7]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要原因。有文獻(xiàn)表明，紅景天苷可減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成[8]。本研究證實(shí)，紅景天苷處理組進(jìn)行缺血再灌注時(shí)大鼠腦組織中MDA和8-OHdG升高程度顯著下降，說明紅景天苷可減弱大鼠腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)紅景天苷抗缺血再灌注損傷的作用可能與其上調(diào)HIF-1基因及其相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。HIF-1a是低氧誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵分子，在缺氧適應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。HIF-1可誘導(dǎo)糖代謝相關(guān)酶如乳酸脫氫酶和己糖激酶等的表達(dá)，從而提高組織在缺氧條件下的能量利用[9]。張金平等[10]指出，紅景天苷可通過PI(3)K/Akt激活離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)并抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，這提示HIF-1a是紅景天苷的一個(gè)靶分子。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可在整體情況下上調(diào)腦組織中HIF-1a的表達(dá)，這進(jìn)一步支持HIF-1a是紅景天苷激活的靶分子。紅景天苷還上調(diào)腦組織乳酸脫氫酶和己糖激酶的表達(dá)，這兩個(gè)HIF-1a的下游分子的激活進(jìn)一步支持紅景天苷上調(diào)HIF-1a表達(dá)的作用。乳酸脫氫酶和己糖激酶表達(dá)增強(qiáng)可提高組織對缺氧的抵抗力，這很可能是紅景天苷抗大鼠腦缺血再灌注損傷的主要原因。腦缺血再灌注誘導(dǎo)HIF-1a表達(dá)，這是組織的一個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)。腦缺血再灌注誘導(dǎo)HIF-1a表達(dá)的程度在紅景天苷處理組較對照組并沒有進(jìn)一步的升高，這也提示紅景天苷處理誘導(dǎo)HIF-1a表達(dá)后可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，使組織發(fā)生損傷較輕，HIF-1a等損傷刺激性表達(dá)的程度相對減小。

總之，我們的研究證實(shí)紅景天苷具有抗腦缺血再灌注損傷的作用，并提出上調(diào)HIF-1a表達(dá)是紅景天苷上述作用的可能的分子機(jī)制。這為臨床應(yīng)用紅景天苷防治腦缺血再灌注損傷提供了依據(jù)。

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(收稿：2015-07-03)

The effects of salidroside on expression of HIF-1 and attenuation of cerebral ischemia-reperfusion injury

Shaanxi Provincial Corps Hospital Chinese People’s Armed Police

Forces Department of Anesthesiology(Xi’an 710054)WangJunCao Yan ChangJiang

ABSTRACTObjective：To confirm the protective effects of salidroside on cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury and explore its molecular mechanism. Methods：SD rats were randomly divided into four groups：normal control， normal rats+salidroside， I/R group， I/R +salidroside. Rats in groups with salidroside treatment were given salidroside (40 mg/kg) for two weeks.I/R rats were treated by the thread ligation in internal carotid artery. In the end of treatment， the brain of each rat was collected.The infarct sizes，the levels of malondialdehyde (MDA) and 8-dydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) in brain tissues，and the expression of HIF-1a， lactate dehydrogenase (LDH) and hexokinase (HK) were observed. Results：Salidroside treatment of normal rats induced a significant increase in the expression of HIF-1a，LDH，HK as compared to normal control. I/R resulted in the increase in the expression of HIF-1a，LDH，HK as compared to normal control. Rats in I/R+salidroside group had a significantly weakened increase in expression of HIF-1a， LDH， HK as compared to I/R group.Infarct sizes were significantly smaller and levels of MAP and 8-OHdG were significantly lower in I/R+salidroside group than those in I/R group.Conclusion：Salidroside induces cerebral HIF-1a expression and increase enzyme levels for glucolysis， which showed protective effects against cerebral ischemia reperfusion injury.

KEY WORDSBrainReperfusion injuryRhodiolosideHypoxia-tnducible factor 1Lactate dehydrogenasesHexokinase

【中圖分類號】R743.32

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.011