肝竇內(nèi)皮細胞凝集素抑制肝星形細胞增殖、膠原合成與分泌的實驗研究*

西安高新醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710075)　孫　安　范郁會　 楊潔英　 江玉剛　 喬立敏　王繼波　李元峰

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肝竇內(nèi)皮細胞凝集素抑制肝星形細胞增殖、膠原合成與分泌的實驗研究*

西安高新醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710075)孫安范郁會 楊潔英▲江玉剛 喬立敏王繼波李元峰

摘要目的：探討肝竇內(nèi)皮細胞凝集素(LSECtin)對肝臟星形細胞(HSCs)增殖和膠原分泌的影響。方法：離體培養(yǎng)大鼠肝星形細胞系 HSC-T6，分為對照組和LSECtin處理組。采用噻唑藍(MTT)比色法和[3H]-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)摻入法檢測 HSC-T6細胞的增殖情況，分別采用[3H]-脯氨酸摻入法和比色法檢測 HSC-T6細胞膠原合成與分泌的情況。結(jié)果：LSECtin劑量依賴性的抑制 HSC-T6細胞增殖，其中10-7mol/L 的LSECtin對HSC-T6細胞增殖的抑制率為50%。另外，LSECtin對于HSC-T6細胞膠原的合成與分泌也有顯著地抑制效應(yīng)，并呈劑量關(guān)系。其中，10-7mol/L 的LSECtin對HSC-T6細胞膠原合成與分泌抑制率分比為55%和52%。結(jié)論：LSECtin是肝星形細胞的增殖、膠原合成與分泌的抑制因子，對于肝纖維化具有潛在的治療價值。

主題詞肝星形細胞細胞增殖肝纖維化@肝竇內(nèi)皮細胞凝集素

大多慢性肝病的發(fā)展經(jīng)歷著共同的過程，從輕微的炎癥發(fā)展到嚴重的炎癥、肝纖維化，最終導致肝硬化。肝纖維化是許多慢性肝病的終末階段。肝纖維化被認為是肝臟對慢性肝損傷所做出的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)模式。在損傷過程中肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞參與了反應(yīng)，激活細胞因子和細胞外信號的產(chǎn)生，引起細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白在肝內(nèi)沉積是肝纖維化發(fā)生的基本機制。肝星形細胞位于竇周間隙，呈周細胞樣排列，伸出長的細胞突起圍繞著肝竇。被激活時肝星形細胞(HSC)增殖并合成細胞外基質(zhì)蛋白，形成肝纖維瘢痕，這在肝纖維化和門靜脈高壓的發(fā)病中起重要作用。肝竇內(nèi)皮細胞凝集素(LSECtin)是C-型凝集素家族中的一員，由軍事醫(yī)學科學院賀福初等首先克隆。它表達在肝臟竇內(nèi)皮細胞和淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細胞，以及胸腺巨噬細胞和外周血樹突細胞(DCs)上[1-2]，在機體免疫中發(fā)揮重要的作用。比如，髓系細胞中的LSECtin能夠調(diào)控抗原捕獲和病原體結(jié)合[3]，能夠粘附埃博拉及SARS病毒，但不結(jié)合HIV及HCV病毒[4]；在保護肝臟免疫調(diào)節(jié)中起著很大作用[5]。本研究以肝星形細胞為研究對象，觀察LSECtin對于細胞增殖，以及膠原合成與分泌的影響，旨在揭示LSECtin在肝纖維化進程中的作用，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1材料重組LSECtin購自美國R&D公司。[3H]-脫氧胸腺嘧啶核苷酸([3H]-TdR)和[3H]脯氨酸均購自北京中國原子能研究所。四甲偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司。脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學科技公司產(chǎn)品。HSC-T6星形細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。按照加入LSECtin的濃度，將細胞分為4組。分別以0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L的LSECtin處理。其中，0 mol/L的LSECtin處理組為對照。

2方法①細胞培養(yǎng)。將細胞培養(yǎng)在含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在5%CO2和95%O2，37℃條件下恒溫孵育。②噻唑藍(MTT)比色法和[3H]-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)摻入法檢測 HSC-T6細胞的增殖情況。接種細胞：用含10%胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個HSC-T6細胞懸液，將細胞置于96孔板中(每孔5×103個細胞)，每孔培養(yǎng)液體積200 μl，培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)基同步化24h，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中加入LSECtin培養(yǎng)24 h，(對照組不給LSECtin)，在最后4h每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μl 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。DNA合成檢測：將細胞置于96孔板中(每孔5×103個細胞)，檢測其表達[3H]-胸苷標記DNA的細胞數(shù)目。每孔培養(yǎng)液體積200μl，培養(yǎng)24h，換無血清培養(yǎng)基同步化24h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中加入LSECtin培養(yǎng)24h，(對照組不給LSECtin)，在最后4h，每孔加入[3H]-胸苷(18.5 kBq/ml)。用放射免疫計數(shù)儀(LS-6500， Beckman Co.CA，USA)檢測每個樣本的放射性。③[3H]-脯氨酸摻入法和比色法檢測 HSC-T6細胞膠原合成與分泌的情況。膠原合成檢測：將細胞置于96孔板(每孔5×103個細胞)，檢測其表達[3H]-脯氨酸標記的膠原的細胞數(shù)。如前所述，換無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中加入LSECtin培養(yǎng)24 h(對照組不給予LSECtin)，在最后4h時每孔加入[3H]-脯氨酸(18.5 kBq/ml)。用放射免疫計數(shù)儀(LS-6500，Beckman Co.CA，USA)檢測每個樣本的放射性。膠原分泌水平檢測：把細胞鋪于90 mm培養(yǎng)皿(1×106個細胞每皿)。置于無血清培養(yǎng)基上同步化24 h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中加入LSECtin培養(yǎng)24 h。采用堿水解法測定所收集各組細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量。操作方法參照說明書。

3統(tǒng)計學方法所有的實驗都重復了至少3次。結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析法(ANOVA)分析各組總體的變異情況，用t檢驗檢測組間差異。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計分析，P<0.05則認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1LSECtin 抑制肝星形細胞增殖見圖1。LSECtin呈劑量依賴性地抑制細胞增殖。與對照組比較，10-9-10-8mol/L的LSECtin對于細胞的MTT光吸收值與[3H]-TdR 摻入沒有顯著改變。當LSECtin增加至10-8mol/L，細胞的MTT光吸收值與[3H]-TdR 摻入降低約40%。當濃度為10-7mol/L時(本實驗使用的最高濃度)，LSECtin減少了MTT吸光值(圖1A)和[3H]-TdR 摻入(圖1B)達50%。

A：MTT比色實驗；B：H3-TdR摻入實驗。與對照組(LSECtin濃度為0 mol/L)比較，**P<0.01

圖1LSECtin對HSC-T6細胞增殖的影響

2LSECtin抑制肝星形細胞膠原合成與分泌見圖2。LSECtin呈劑量依賴性地抑制細胞的[3H]脯氨酸摻入(圖2A)，并顯著降低細胞培養(yǎng)液中的羥脯氨酸濃度(圖2B)。當濃度為10-7mol/L時(本實驗使用的最高濃度)，LSECtin對[3H]脯氨酸摻入的抑制率為55%，使細胞培養(yǎng)液中的羥脯氨酸濃度降低52%。

A：[3H]-脯氨酸摻入實驗；B：堿水解法測定細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量。與對照組(LSECtin濃度為0 mol/L)比較，**P<0.01

圖2LSECtin對HSC-T6細胞膠原合成與分泌的影響

討論

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)LSECtin有效抑制肝星形細胞增殖，以及膠原的合成與分泌。該結(jié)果提示：LSECtin一方面可能通過抑制肝間質(zhì)細胞的增殖，從而減少間質(zhì)的組織的量；另一方面，可能通過抑制間質(zhì)細胞產(chǎn)生膠原的數(shù)量，減少膠原組織在肝臟的沉積，從而抑制肝纖維化。但這還需要整體水平動物實驗證據(jù)的支持，相關(guān)機制也有待于進一步研究。LSECtin可能成為一種新的肝臟的保護藥物，用于防治各種疾病導致的肝纖維化病變。同時，一些能夠提高內(nèi)源性LSECtin表達，或者抑制內(nèi)源性LSECtin降解的物質(zhì)，都可能成為新的抗肝臟纖維化候選新藥。

LSECtin是從肝臟中發(fā)現(xiàn)的 C型凝集素受體。LSECtin 特異表達于肝臟的竇內(nèi)皮細胞(半抗原提呈細胞)和 Kupffer 細胞(器官特異性巨噬細胞)，識別活化 T 細胞表面的未知配體，負調(diào)節(jié) T 細胞活化，從而抑制的急性肝炎的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果說明 LSECtin 在肝臟局部免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1-2]。常遠鴻等[6]研究認為：高胰島素可能通過磷酸化ERK，促進HSC-T6增殖，上調(diào)MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄，促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展，表明肝纖維化也是一個有多種因素參與的肝臟免疫過程。這也從另一個側(cè)面提示，LSECtin在肝纖維化過程中的可能的重要作用。由于本研究是以離體培養(yǎng)的肝星形細胞為研究對象，這就排出了在體條件下其他免疫細胞、免疫因子的參與。雖然本研究的結(jié)果證實了LSECtin對肝星形細胞的直接效應(yīng)，但是其可能的通過免疫調(diào)節(jié)而影響肝纖維化的效應(yīng)還需要進一步的實驗證實。

綜上所述，LSECtin是一種潛在的肝纖維化抑制因子，但是其在體效應(yīng)，以及確切機制還有待于進一步研究。

參考文獻

[1]Xu F，Liu J，Liu D，etal.LSECtin expressed on melanoma cells promotes tumor progression by inhibiting antitumor T-cell responses[J].Cancer Res，2014，74(13)：3418.

[2]Liu B，Wang M，Wang X，etal.Liver sinusoidal endothelial cell lectin inhibits CTL-dependent virus clearance in mouse models of viral hepatitis[J].J Immunol，2013，190(8)：4185-4195.

[3]van den Berg LM，Gringhuis SI，Geijtenbeek TB.An evolutionary perspective on C-type lectins in infection and immunity[J].Ann NY Acad Sci，2012，1253：149-158.

[4]Koharudin LM，Gronenborn AM.Antiviral lectins as potential HIV microbicides[J].Curr Opin Virol，2014，7：95.

[5]Pedersen M，Seetharam A.Infections after orthotopic liver transplantation[J].J Clin Exp Hepatol，2014，4(4)：347.

[6]常遠鴻，萇新明，任莉. 高胰島素對肝星狀細胞HSC-T6增殖及MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[J].陜西醫(yī)學雜志，2012，41(5)：531-534.

(收稿：2015-07-03)

LSECtin inhibits the proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSCs

Xi’an Gaoxin Hospital (Xi’an 710075)Sun AnFan Yuhui Yang Jieyinget al

ABSTRACTObjective：To investigate the effects of LSECtin (1iver and lymph node sinusoidal endothelial cells lectin) on the proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 hepatic stellate cells. Methods：HSC-T6 cells from rats liver were cultured in vitro， and assigned into control and LSECtin treatment group.MTT assay and H3-TdR incorporation were performed to evaluate the proliferation of HSC-T6 cells.[3H]-Pro incorporation and colorimetry methods were applied respectively to detect the synthesis and secretion of collagen in HSC-T6 cells.Results：LSECtin inhibited the proliferation of HSC-T6 cells in a dose-dependent manner.The inhibition ratio of LSECtin at 10-7mol/L was 50%.In addition，LSECtin inhibited the synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 cells dose-dependently.At the dose of 10-7mol/L，LSECtin decreased the synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 cells cells by 55% and 52% respectively.Conclution：LSECtin is an inhibitor of proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSCs，suggesting potential therapeutic values against liver fibrosis.

KEY WORDSHepatic stellate cellsCell proliferationLiver fibrosis@LSECtin

【中圖分類號】R575.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.004

*陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研計劃項目(D44)

▲通訊作者