半干旱黃土區(qū)藍藻液體培養(yǎng)條件研究

馬淑敏，法　蕾，孫長忠，辛學兵

(中國林業(yè)科學研究院華北林業(yè)實驗中心，北京 102300)

?

半干旱黃土區(qū)藍藻液體培養(yǎng)條件研究

馬淑敏，法蕾，孫長忠，辛學兵*

(中國林業(yè)科學研究院華北林業(yè)實驗中心，北京 102300)

摘要：以半干旱黃土區(qū)藻類結(jié)皮中的藍藻為研究對象，對其室內(nèi)液體培養(yǎng)所需營養(yǎng)、光照及溫度條件進行研究，揭示不同條件下藍藻生長的規(guī)律。結(jié)果表明：N、P濃度不同藻種生長情況不同，N10、P1濃度下藻種生物量最大；不同光照時間對比研究發(fā)現(xiàn)，光照12h藻種生長穩(wěn)定，而且生物量高峰值最大，長時間光照16h繁殖快衰亡也快，生長不穩(wěn)定；溫度也是影響藻種生長的重要條件，15℃、室溫和20℃時，藻種生長均比較穩(wěn)定，但15℃藻種生物量一直比較低，35℃條件下，藻種生長不穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：黃土高原；藍藻結(jié)皮；生物量；液體培養(yǎng)

我國干旱、半干旱地區(qū)面積占總國土總面積1/2[1]，黃土高原區(qū)作為水土流失和生態(tài)環(huán)境破壞最嚴重的地區(qū)之一，因其水分養(yǎng)分匱乏，生態(tài)環(huán)境脆弱，生態(tài)環(huán)境治理是一項艱巨而重要的任務[2-6]。在干旱、半干旱地區(qū)，70%以上的范圍覆蓋著生物結(jié)皮[7-8]，土壤生物結(jié)皮是由細菌、真菌、藻類、地衣和苔蘚等形成的一種混合體[9]，在我國西部和北部地區(qū)有著廣泛的分布[10]，其中藻結(jié)皮是生物結(jié)皮的主要組成部分，藻類結(jié)皮是指生長在于旱、半干旱地區(qū)的藻類與其下層很薄的土壤共同形成的一個復合的生物土壤層[11]，藻類作為先鋒生物，常在條件惡劣的環(huán)境下生存，并影響改變著周圍環(huán)境[10，12-13]。

藍藻結(jié)皮在藻結(jié)皮中占據(jù)重要地位，在干旱和半干旱地區(qū)廣泛分布，藍藻結(jié)皮中的大量絲狀藍藻形成膠鞘和分泌藍藻細胞胞外多糖[14]，絲狀藍藻和其分泌的胞外多糖起著捆綁、黏結(jié)沙粒和固定沙粒的作用，最終產(chǎn)生減少水蝕和風蝕的生態(tài)效應，藍藻在藻結(jié)皮的形成及藻結(jié)皮演替中都具有重要作用[15]。

鑒于藻類結(jié)皮對半干旱黃土區(qū)水土保持的重要意義，許永霞等[16]對人工培養(yǎng)藻結(jié)皮的環(huán)境條件進行了研究，而藻種來源則成為人工培育藻結(jié)皮的首要條件。藻類生物量的影響因子包括水分、光照、PH值、溫度及養(yǎng)分等等，各因子間的交互作用使得生物量對各因子的反應效果不同[12，17-18]。 例如，低溫光照明顯抑制藍藻結(jié)皮活性，而低溫黑暗卻能促進藍藻活性和形態(tài)恢復[19]，藻生長需要光照，但是紫外輻射過強會影響藻結(jié)皮的生產(chǎn)力[20]。研究藍藻室內(nèi)水培條件具有重要意義，為大批量生產(chǎn)藻種提供技術(shù)基礎(chǔ)，進而為人工野外反接培育人工藻結(jié)皮治理黃土區(qū)水土流失提供豐富的藻種資源。

1材料與方法

1.1藻種

把在半干旱黃土高原區(qū)采集土壤藻類結(jié)皮，裝入塑料袋中，帶回室內(nèi)分離藍藻并純化，用小罐頭瓶進行液體培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基

選用BG-11培養(yǎng)基配方，主要成份為：NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，Na2CO3，檸檬酸，檸檬酸鐵，EDTANa2，微量元素溶液A5。

1.3培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)藍藻用的罐頭瓶洗凈，然后倒入配置好的BG-11培養(yǎng)基，每瓶約60 mL，用封口膜封口，在121℃高壓下滅菌20 min.。收集已分離培養(yǎng)的生長狀況良好的藍藻，破碎25 min，攪勻后用移液槍取10 mL接種到罐頭瓶中進行培養(yǎng)，藍藻培養(yǎng)過程中每天進行手動震蕩搖勻。

1.4試驗設計

1.4.1 營養(yǎng)成分含量試驗 在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量及室內(nèi)室溫且自然光條件下進行。每個處理設90個樣，連續(xù)監(jiān)測30 d，每天取樣3個(即3個重復)進行測定。

(1) N元素含量試驗： K2HPO4含量(即P含量)不變，設置加入150 g·L-1NaNO3共4個處理，即0、5、10、20 mL。

(2)P元素含量試驗：NaNO3含量(即N含量)不變，設置加入40 g·L-1K2HPO4共4個處理，即0、1、2、5 mL。

1.4.2光照時間試驗在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量及室溫室內(nèi)培養(yǎng)架上進行，采用日光燈照射，每個培養(yǎng)架上安裝光照時間分控器；試驗監(jiān)測45 d，進行18次取樣測定；光照時間設3個處理，即16、12、8 h。

1.4.3溫度控制試驗在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量、室內(nèi)自然光照條件下，培養(yǎng)箱中進行；監(jiān)測45 d，進行18次取樣測定；溫度設4個處理，即15℃、20℃、室溫(27℃左右)、35℃。

1.5測定方法

藻種生物量用UV-2600型紫外可見分光光度計680 nm波長測定吸光度值，繪制生長曲線。具體測定方法見文獻[21]。

1.6數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與相關(guān)性分析采用Excel2007和SPSS16.0分析軟件。

2試驗結(jié)果

2.1不同營養(yǎng)條件對藍藻生長的影響

藻類的生長與培養(yǎng)液的營養(yǎng)條件密切相關(guān)，N、P是影響藻種繁殖的兩大主要營養(yǎng)成分。通過研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基成分N或P濃度為0的情況下藍藻生長停滯，3～5 d時間藻種全部變黃死亡；藻類的繁殖速度與濃度和時間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系，其余各組分，各濃度藻種在生長到10～14 d左右時，增長速度最快，且均在15 d左右達到高峰值，然后進入平穩(wěn)生長時期，在約18 d左右開始平緩下降，逐漸衰亡，這一過程比較緩慢(圖1、圖2)。

由圖1可以看出，P1含量不變的情況下，N營養(yǎng)各濃度梯度下藻種生物量高峰值不同。N10濃度藻種生物量高峰值最大，分別比N5、N20高出97.07%和96.95%，經(jīng)方差分析，N10濃度下藻種繁殖高峰期生物量與N5、N20濃度藻種繁殖高峰期生物量有極顯著差異(p<0.01)；由圖2可見，N10含量不變的情況下，P2濃度下藻種生物量的高峰值與P5濃度下藻種生物量的高峰值有極顯著差異(p<0.01)。通過圖1 、圖2對比分析， 配方N10P1與N10P2相比較，N10P1藻種生物量最大值極顯著高于N10P2藻種生物量最大值(p<0.01)，可以得出，最合適的營養(yǎng)比例為N10P1配方。

2.2不同光照時間對藍藻生長的影響

光照是影響藻類生長的重要環(huán)境條件之一。由圖3可見，光照時間16 h的藻種生物量在第4 d時達到最大，當藻種生長到第11 d時，生物量大幅下降,隨后開始平緩生長且逐漸衰亡，而光照12 h和8 h的藻種前期生長比較緩慢，生物量均在15 d左右達到高峰，由此表明，在藻類培養(yǎng)初期，持續(xù)而充足的光照有利于藻類的快速繁殖。通過方差分析，光照時間12 h的藻種生物量高峰值與8 h、16 h光照的藻種生物量高峰值均有極顯著差異(p<0.01)；光照時間12 h的藍藻生物量在第18 d左右大幅下降，隨后進入平緩生長期，光照時間8 h的藍藻整個生長過程都平緩，由此表明，藻類培養(yǎng)后期，適當減弱光照反而有利于藻種培養(yǎng)時間的延長，因為藻類繁殖早期，需要大量光照進行光合作用，而后期，由于培養(yǎng)基養(yǎng)分消耗殆盡，減弱光照，就可以減慢藻類的生長速度，減緩藻類的死亡。

圖1　N含量不變條件下不同P濃度藍藻生長曲線

圖2　P含量不變條件下不同N濃度藍藻生長曲線

2.3不同溫度水平對藍藻生長的影響

溫度也是影響藻類生長的一個重要環(huán)境條件。研究表明(圖4)，在高溫35℃條件下藻種前期繁殖最快，生長到第3 d時，生物量是其它溫度水平的3倍多，第7 d生物量即達到高峰值，之后,進入10 d左右的波動期，到第21 d前后生物學大幅下降。由此可見，高溫條件下，藻種繁殖快衰亡也快；室溫下，藻種平緩生長至第18 d左右生物量達到高峰值，而且一直持續(xù)到第27 d左右才開始大幅度下降，藻種的快速繁殖期時間最長，隨后平緩生長逐漸衰亡，說明室溫是最利于藻種生長的溫度條件；20℃條件下藍藻在21 d左右生物量最大，比室溫下藻種生物量最大值低24.9%，隨后生物量大幅下降；15℃條件下藻種一直平穩(wěn)緩慢生長，沒有出現(xiàn)藻種大量繁殖的現(xiàn)象，表明溫度過低不利于藻種的生長。

圖3　不同光照時間下藍藻生長曲線

圖4　不同溫度條件下藍藻生長曲線

3結(jié)論與討論

本研究從野外藻類結(jié)皮中分離出藍藻并進行室內(nèi)液體培養(yǎng)，在藻種生長繁殖環(huán)境發(fā)生巨大變化，藻種液體培養(yǎng)適應期后，收集生長狀況良好的藻種,再轉(zhuǎn)接到不同營養(yǎng)條件的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和光譜條件下試驗,結(jié)果為營養(yǎng)條件不同與藻類繁殖生長呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系:N、P、K作為藻類生長重要的營養(yǎng)成分，當N、P含量不同時，藻種的生長繁殖受到很大影響，在N10P1營養(yǎng)配方下藻種的生物量顯著高于其它營養(yǎng)配方，說明藻種的繁殖不僅需要營養(yǎng)，而且各養(yǎng)分還需保持合適的濃度比例，才會實現(xiàn)藻種的快速繁殖和大量繁殖；光照時間不同，藻種生長呈現(xiàn)不同的規(guī)律，光照12 h的藻種生長情況最好，最長光照16 h的藻種繁殖速度快但衰亡也最快，由此說明，藻類生長初期，充足的光照有利于藻類的快速繁殖，而中后期減少光照反而有利于藻種生長時間的延長，原因可能是藻類繁殖早期，需要大量光照進行光合作用，而到了中后期，隨著培養(yǎng)基養(yǎng)分的消耗，減弱光照，可以減慢藻類的生長速度，從而減緩藻類的死亡；不同溫度水平影響藻種的生長繁殖，20℃和室溫下藻種生長穩(wěn)定，室溫下藻種繁殖更多，溫度過高(35℃)藻種快速繁殖，但也加快了藻種的死亡，溫度過低(15℃)，藍藻生長情況較穩(wěn)定，但生物量較低，可能低溫在一定程度上抑制了藻種生長，不利于藻種的繁殖。

藍藻室內(nèi)液體的培養(yǎng)，控制好藻種生長所需的營養(yǎng)、溫度、光照等環(huán)境條件非常重要，以此可以為今后用大桶、大池子人工培養(yǎng)繁殖大批量藻種奠定一定基礎(chǔ)，進而提供野外人工培養(yǎng)藻結(jié)皮治理黃土區(qū)水土流失所需的藻種資源。關(guān)于人工培養(yǎng)藍藻今后仍需要進行深入研究，比如：藻種生長繁殖與生長時間的相關(guān)性，因為研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境條件下，藻種繁殖速度、繁殖的量以及衰亡時間都有所不同，通過何種手段控制藻種衰亡，延長繁殖時間或是恢復其活性，都需要深入地研究。

參 考 文 獻

[1]張延東. 試論半干旱黃土區(qū)雨水集流注射灌根抗旱植樹技術(shù)[J]. 甘肅科技，2008，24(19):149-151.

[2]劉中奇，朱清科，秦偉,等. 半干旱黃土區(qū)自然恢復與人工造林恢復植被群落對比研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學報，2010，19(4)：857-863.

[3]李萍，朱清科，劉中奇,等.半干旱黃土區(qū)地上生物量對立地因子的響應[J].中國水土保持科學,2012，l0(2)：50-54.

[4]許智超，張巖,劉憲春,等. 半干旱黃土區(qū)退耕還林十年植被恢復變化分析——以陜西吳起縣為例[J]. 生態(tài)環(huán)境學報,2011，20(1)：91-96.

[5]張文輝，劉國彬．黃土高原植被生態(tài)恢復評價、問題與對策[J].林業(yè)科學，2007，1(1)： 102-106．

[6]WANG C，OUYANG H，Maclaren，V， eta1．Evaluation of the economic and environmental impact of converting cropland to forest：A case study in Dunhua County，China [J].Journal of Environmental Management，2007，85：746-756.

[7]BELNAP J，LANGE O L．Biological soil crusts，structure，function and management[M]．Heidelberg：Springer，2003：371．

[8]吳玉環(huán)，高謙，于興華．生物土壤結(jié)皮的分布影響因子及其監(jiān)測[J].生態(tài)學雜志，2003， 22(3)：38-42．

[9] Maik Veste. Importance of biological soil crusts for rehabilitation of degraded arid and semi-arid ecosystems [J]. Science of Soil and Water Conservation，2005，3(4)：42-47.

[10]陳蘭周，劉永定，李敦海，等．荒漠藻類及其結(jié)皮的研究[J]．中國科學基金，2003(3)： 90-93.

[11]BELNAP J，HARPER K T，WARREN S D．Surface disturbance of cryptobiotic soil crusts：Nitrogenase activity，chlorophyll content，and chlorophyll degradation [J]．Arid Soil Research and Rehabilitation，1994，8(1)：1-8．

[12]胡春香，張德祿，劉永定．干旱區(qū)微小生物結(jié)皮中藻類研究的新進展[J]．自然科學進展，2003， 13(8)：791-795．

[13]呂建亮，廖超英，孫長忠,等. 黃土地表藻類結(jié)皮分布影響因素研究[J]. 西北林學院學報，2010，25(1)：11-14.

[14]ISSA O M， TRICHET J，DEFARGE C，eta1．Morphology and micro structure of micro biotic soil crusts on a tiger bush sequence (Niger，Sahe1 )[J]．Catena，1999，37： 175-196．

[15]張丙昌，張元明，趙建成,等. 準噶爾盆地古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮藍藻研究[J].地理與地理信息科學，2005,21(5)：107-109.

[16]許永霞，廖超英，孫長忠,等. 黃土藻類回接之生境條件研究[J]. 西北林學院學報，2012，27(2)：30-33.

[17]胡春香，劉永定．土壤藻生物量及其在荒漠結(jié)皮的影響因子[J].生態(tài)學報，2003，23 (2)：284-291.

[18]Johansen J R．Cryptogamic crusts of semiarid and arid lands of North America[J].J Phycol，1993，29：140.

[19]饒本強，李華，熊瑛,等. 實驗室條件下藍藻結(jié)皮對低溫光照脅迫的響應與微結(jié)構(gòu)變化[J]. 環(huán)境科學，2012，33(8)：2793-2803.

[20]蘇延桂，李新榮，趙昕,等. 紫外輻射增強對不同發(fā)育階段荒漠藻結(jié)皮光合作用的影響[J]. 中國沙漠，2011，31(4)：889-893.

[21]閆德仁，楊俊平， 安曉亮,等．荒漠藻同沙結(jié)皮試驗研究初報[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2004，18(5)：147-150.

Liquid Culture Conditions of Cyanobacteria in Semi-arid Region of Loess Plateau

MA Shu-min1，F(xiàn)A Lei1，SUN Chang-zhong1

(1.NorthExperimentalCenterofForestry,CAF,Beijing102300)

Abstract:Cyanobacteria of algal crust in semi-arid region of Loess Plateau as object,its liquid culture conditions regarding nutrition,illumination strength and temperature were studied to reveal the influence of different conditions on algae growth. The results showed that N and P concentrations influenced the growth of algae. The biomass of algae was maximum under the N10 and P1 treatments. The algae grew stably under the 12 hours light and the biomass peak is maximum. The algae grew unstably under 16 hours light，propagated and degradedly quickly. The temperature is an important condition influencing the growth of algae. The algae grew stably at the 15℃,20℃and the room temperatures,but the biomass of algae was low at 15℃.

Key words:Loess Plateau; cyanobacterial crusts; biomass; liquid culture

中圖分類號:Q949.22

文獻標識碼:A

文章編號:1001-2117(2016)02-0001-04

作者簡介：馬淑敏(1981-)，女，漢，山東德州人，碩士，工程師，主要從事土壤生態(tài)學研究。

基金項目：“十二五”國家科技支撐項目(2015BAD07B0202)。

收稿日期：2015-07-18