非雙原核胚胎利用價(jià)值的探討

●易曉芳 席紅琳 羅偉 詹玲

非雙原核胚胎利用價(jià)值的探討

●易曉芳 席紅琳 羅偉 詹玲

目的：分析來源非雙原核胚胎在體外受精-胚胎移植周期中的利用價(jià)值。方法：回顧性分析接受常規(guī)體外授精-胚胎移植助孕患者2698個(gè)新鮮周期，比較來源雙原核胚胎（2PN-E）與無原核胚胎（0PN-E）及單元核胚胎（1PN-E）的卵裂率、胚胎利用率、妊娠率，并隨訪其妊娠結(jié)局。結(jié)果：1、2PN胚胎與0PN、1PN胚胎卵裂率為97.8%VS28.3%VS92.1%（p值＜0.0001）, 0PN胚胎卵裂率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常2PN胚胎及1PN胚胎；2、2PN胚胎與0PN、1PN胚胎卵裂胚胎的胚胎利用率為64.9%VS23.4%VS25.7%（p值＜0.0001）, 0PN、1PN胚胎利用率也低于正常2PN胚胎；3、新鮮移植2PN胚胎與0PN、1PN胚胎妊娠率為35. 7%VS13.6%VS 0%,（p值＜0.05）, 0PN胚胎妊娠率低于正常2PN胚胎，但具有一定的妊娠率，而且移植周期中部分包含0PN胚胎患者移植妊娠率妊娠率為37.9%，比正常純2PN胚胎移植患者稍高（p值＞0.05）,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性；1PN胚胎妊娠率為0，而且移植周期中部分包含1PN胚胎患者移植妊娠率妊娠率為23.8%，比正常純2PN胚胎移植患者低（p值＜0.05）,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性；4、其中3例純0PN-E移植妊娠患者均成功分娩健康嬰兒。結(jié)論：在 IVF-ET 治療周期中，對于 2PN-E 極少或無 2PN-E 的周期，0PN-E 可考慮進(jìn)行胚胎移植，1PN胚胎相對利用價(jià)值低。

體外受精-胚胎移植；未見原核胚胎（0PN-E）；妊娠率;胚胎發(fā)育潛能

體外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)迄今已發(fā)展近40年，如今，隨著二胎政策的放開，如何提高不孕不育癥患者尤其是高齡患者胚胎利用率，為其提供更多的妊娠機(jī)會，是輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域的重要研究課題之一。卵母細(xì)胞在授精 16-20h 后觀察有無2 個(gè)原核（pronucleus，PN ），是判定胚胎是否正常受精的重要依據(jù)，但有些周期中含有非雙原核胚胎，即未見原核來源的胚胎（0PN-E ）及單元核胚胎（1PN-E），即授精16-20h未觀察到原核或單元核，但胚胎第二天發(fā)生分裂，有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，在IV F-ET 周期中，約有 30～ 40% 的卵子在鏡下觀察表現(xiàn)為未見原核，這部分胚胎能否用于移植、如何選擇尚存爭議。國外已有來源非雙原核的胚胎移植獲得妊娠的文獻(xiàn)報(bào)道[2]，國內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道。本文通過比較來源2原核胚胎（2PN-E）組與0PN-E組、1PN-E組卵裂率、胚胎利用率、妊娠率，以期評價(jià)非雙原核卵裂期胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2011年1月～2015年12月在本中心行 IVF周期患者2698例，其中新鮮周期移植全部為2PN-E 周期1921例，部分0PN-E周期65例，全部0PN-E周期22例，部分1PN-E周期42例，全部1PN-E周期5例。

1.2 方法

①控制性超促排卵及取卵

采用本生殖中心常規(guī)超促排卵方案，當(dāng)主導(dǎo)卵泡中有以下情況之一時(shí)： 1 個(gè)直徑達(dá) 18 mm; 2 個(gè)直徑達(dá) 17 mm; 3 個(gè)直徑達(dá) 16 mm，肌注人絨毛膜促性腺激素(hu-man chorionic gonadotrophin，HCG )5 000～ 10 000U，36 h 后在陰道 B 超引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。

②精液處理、受精、卵裂及胚胎觀察

常規(guī)體外受精：患者丈夫于取卵當(dāng)日手淫取出精子，密度梯度離心法+上游法處理后，調(diào)精子密度約至2-3萬條精子/卵。一般于取卵后2～5 h，常規(guī)方法體外受精，受精后 17～ 19 h 觀察受精情況。第 2 天或第 3 天觀察胚胎時(shí)記錄卵裂球的數(shù)目、有無碎片及形態(tài)是否對稱。

③移植胚胎的選擇

第三天胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)為 ：Ⅰ級 ：卵裂球數(shù) 6～ 10 個(gè)，卵裂球等大均勻，碎片 ＜10% ；Ⅱ級 ：卵裂球數(shù) 7～ 9 個(gè)，卵裂球等大均勻，碎片10%～ 25% ；Ⅲ級 ：卵裂球大小不均勻，碎片 25%～ 50% ；Ⅳ級 ：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片＞50% ；其中Ⅰ～Ⅲ級為可利用胚胎予以移植。

④臨床妊娠的確認(rèn)

選擇胚胎進(jìn)行宮腔內(nèi)移植，移植 28-35d 后在 B 超下進(jìn)行監(jiān)測，見到孕囊者為臨床妊娠，移植后予以黃體酮或地屈孕酮支持黃體功能。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

常規(guī)IVF周期2698周期，獲卵總數(shù)24497枚，其中2PN為16000個(gè)，0PN為5285個(gè)，1PN為763個(gè)。2PN胚胎卵裂率為97.8%，胚胎利用率64.9%，0PN胚胎卵裂率為28.3%,胚胎利用率23.4%，1PN胚胎卵裂率為92.1%,胚胎利用率25.7%（表1）。

2.2 妊娠結(jié)局

新鮮周期移植全部為2PN-E 周期1921例，部分0PN-E周期65例，全部0PN-E周期22例，部分1PN-E周期42例，全部1PN-E周期5例。新鮮移植2PN胚胎與0PN、1PN胚胎妊娠率為35. 7%VS13.6%VS 0% (p值＜0.05),移植胚胎部分包含0PN-E妊娠率46.2%,移植胚胎部分包含1PN-E妊娠率23.8%（表2），其中3例純0PN-E移植妊娠患者均成功分娩健康嬰兒（表3）。

表1 2PN胚胎與0PN胚胎卵裂率、胚胎利用率的比較

表2 2PN胚胎移植與0PN胚胎移植組妊娠結(jié)局的比較

表3 移植全部0PN胚胎妊娠患者結(jié)局隨訪

3 討論

3.1 0PN-E 的可能形成機(jī)制及利用價(jià)值

一般情況下，0PN 的可能形成機(jī)制有以下幾個(gè)方面 ：1、未受精，2、已受精，但若原核形成延遲，原核在授精后20 h尚未出現(xiàn)或是由于原核提前融合而16小時(shí)早消失，則在原核觀察時(shí)間（授精后 16～ 20 h ）觀察為0PN，3、沒有在合適的時(shí)間（授精后 16～ 20 h）去觀察胚胎。因此來源 0PN 的卵裂期胚胎在這些情況均可能出現(xiàn)：①未受精 ：雖然未受精，但因?yàn)槟承├砘蛩氐拇碳?，?dǎo)致卵母細(xì)胞孤雌激活，恢復(fù)并完成第二次減數(shù)分裂，發(fā)生卵裂從而形成胚胎[3]；或者雙雌胚胎，表現(xiàn)為未見原核及單個(gè)極體（1PB），其形成機(jī)制可能是未分裂出來的第二極體參與到核遺傳物質(zhì)的形成，Munne S 等通過 FISH和多態(tài)標(biāo)志分析發(fā)現(xiàn) 4個(gè) O PN l個(gè)極體（PB）胚胎中 2 個(gè)為二倍體雙雌胚胎[4]。②正常受精 ：受精卵為正常受精，但由于原核消失早或觀察時(shí)間晚未觀察到原核，但有些正常受精胚胎存在非整倍體異常 ：國內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，采用微陣列－比較基因組雜交（microarray-CG H ）染色體分析對 4 個(gè) 0PN 胚胎進(jìn)行檢測，均呈非整倍性變異。③各種異常受精 ：如多精受精、精子染色體解聚異常、雌性原核形成異常等，由于原核消失早或觀察時(shí)間晚未觀察到原核。

從0PN-E 的可能形成機(jī)制中，可以看到部分0PN-E來源正常受精胚胎，理論上這類胚胎是可以利用的。本研究中0PN胚胎卵裂率為28.3%,胚胎利用率23.4%，全部0PN-E周期新鮮移植妊娠率13.6%,移植胚胎部分包含0PN-E妊娠率46.2%，說明全部或部分移植 0PN-E 不影響妊娠結(jié)局，而且，對于只有0PN-E的患者，可以提供妊娠機(jī)會。馬水英,陳子江等[6]研究了3938個(gè)IVF 周期中，2PN 來源胚胎的囊胚形成率與 0PN比較，無顯著差異(P＞0． 05)，2 種受精卵來源的優(yōu)質(zhì)囊胚在凍融周期的臨床妊娠率無顯著差異2PN,55． 6 %， OPN55． 1% (P＞0． 05)。

全部移植 0PN-E 或部分移植 0PN-E 的周期中，均有健康嬰兒出生，充分說明 0PN-E 可以在宮腔內(nèi)種植并且發(fā)育成健康胎兒。由此，在無2PN-E 或 2PN-E 極少的情況下，優(yōu)質(zhì) 0PN-E 可以作為備選胚胎進(jìn)行移植。這一結(jié)論與國外報(bào)道的結(jié)論相一致[2][7][8]。

國內(nèi)鄒林兵，戴志俊等人[9]研究了IVF-ET治療中，21個(gè)完全來源0PN的卵裂期胚胎新鮮移植周期，臨床妊娠6例（9胎），其中3例活產(chǎn)（3男2女），2例流產(chǎn)（3胎），1例異位妊娠.此外，李明 ， 喬杰 等[10]研究了101 例新鮮移植完全來源于0PN 胚胎中， 99 例移植分裂期 胚 胎，臨床妊娠率為：9.09%(9/99)，著床率：7.09%(9/127)；妊娠結(jié)局：1例胎停育，2例繼續(xù)， 6個(gè)健康嬰兒出生。移植囊胚2 例，沒有妊娠。這些研究都表明在無其它可選胚胎的特殊情況下，0PN-E移植具有一定的移植價(jià)值。

3.2 1PN-E 的可能形成機(jī)制及利用價(jià)值

卵子的孤雌激活、雌原核或雄原核形成異常及融合、雌雄原核發(fā)育不同步是產(chǎn)生1PN-E的可能原因。在IVF中，卵子的成熟度并不相同，非成熟的卵子在與精子結(jié)合后，即使精子進(jìn)入卵子，但是精子核不能發(fā)生解聚，形成不了雄原核，隨著卵子的體外繼續(xù)培養(yǎng)并成熟，卵子經(jīng)過激活后已經(jīng)發(fā)生了皮質(zhì)反應(yīng)，雌原核形成，卻不能形成雄原核，即孤雌激活，從而形成單元核胚胎，即1PN-E 。若 1PN-E是由觀察前發(fā)生了原核融合，那么這類胚胎經(jīng)過卵裂后還是具有正常核型的,理論上是具有利用價(jià)值的。

3.3 非雙原核來源胚胎安全性

雖然研究結(jié)果表明0PN來源胚胎具有一定利用價(jià)值，但是畢竟從發(fā)生機(jī)制上來看，0PN-E可能來自孤雌激活或異常受精胚胎，若此類胚胎植入，將會導(dǎo)致嚴(yán)重后果。國外Soeda S等[11]研究發(fā)現(xiàn)，0PN來源胚胎中，18、X、Y 染色體核型異常率較高，且性染色體單體及三體的情況比較普遍若此類胎兒誕生，極有可能出現(xiàn)畸形等嚴(yán)重后果。

國內(nèi)一些研究，如石潔 等［12］利用熒光原位雜交(fluorescent in-situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)對未見到原核的 MII 卵發(fā)育來的胚胎和低形態(tài)評分的 2PN 胚胎進(jìn)行性染色體及 18 號染色體非整倍體分析，結(jié)果前者染色體異常率為 47. 5%，后者染色體異常率為 48. 5%，二者胚胎染色體異常率相近，甚至0PN-E稍低于低形態(tài)評分的 2PN 胚胎。進(jìn)一步證明在胚胎數(shù)少的情況下，相比低形態(tài)評分的2PN 胚胎，優(yōu)質(zhì) 0PN-E 可以作為備選移植胚胎。章師平，曹云霞等[13]通過熒光原位雜交技術(shù)，檢測體外受精周期中非二原核來源胚胎的性染色體倍性，移植周期中 0PN-E的單倍體率、二倍體率、多倍體率以及嵌合體率分別為7.1 4 %、5 3.5 7%、2 5%和 1 4.2 9%，1PN-E的單倍體率、二倍體率、多倍體率以及嵌合體率分別為 50%、40%、0和 10 %。也就是說，在非雙原核胚胎中，正常二倍體胚胎還是占多數(shù)，移植相對安全度上升。也有研究顯示［14］IVF-1PN來源的胚胎中50% 左右為二倍體，一半合子中有Y染色體。

針對孤雌激活胚胎，國內(nèi)有針對小鼠進(jìn)行研究[15]，利用不同電脈沖參數(shù)和激活液對小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電激活孤雌胚體外發(fā)育時(shí)序比正常胚胎慢，但囊胚細(xì)胞數(shù)與對照組差異不顯著。它們經(jīng)胚胎移植后，其中的一部分能夠著床，但著床率僅為3.6% ，極顯著低于對照組(67%,P＜0. 01)，也就是說如果0PN-E來源于孤雌激活胚胎，則絕大部分會著床失敗。本研究中0PN-E胚胎具有一定妊娠率，并分娩正常胎兒，但1PN-E胚胎結(jié)局差，部分含1PN-E并不能提高妊娠率，純1PN-E移植組無一妊娠，提示1PN-E利用價(jià)值可能較低，但由于本研究中，純1PN-E移植組僅5人，例數(shù)少，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對于非雙原核胚胎，經(jīng)過體外囊胚培養(yǎng)，一旦形成囊胚，其正常核型的比例非常高[16]，再結(jié)合胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)，從中篩選出正常的胚胎進(jìn)行移植，進(jìn)一步從技術(shù)上提供安全保證。

綜上可見，在無 2PN-E 或 2PN-E 數(shù)極少的 IVF 周期中，移植優(yōu)質(zhì)0PN-E 在理論上是可行的，能夠增加IVF 周期的利用率，減輕患者經(jīng)濟(jì)壓力和心理壓力。本中心已有患者全部移植 0PN-E 并分娩外觀正常嬰兒，說明在無 2PN-E 或 2PN-E 極少的情況下，0PN-E 可作為備選移植胚胎。雖然部分或全部移植 0PN-E 可獲正常妊娠，但其移植的倫理性、安全性仍需要深度探討，如何能從0PN-E中挑選出正常受精胚胎將值得進(jìn)一步研究。針對1PN-E，由于本中心例數(shù)所限，結(jié)果提示妊娠結(jié)局差，需要更大數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

（作者單位：湖北省宜昌市三峽大學(xué)仁和醫(yī)院）

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