初探在RSK4變異體3的相互作用蛋白

●田斯琦 劉日強 楊華偉

初探在RSK4變異體3的相互作用蛋白

●田斯琦 劉日強 楊華偉

目的：尋找RSK4(核糖體S6蛋白激酶4)第3變異體的相互作用蛋白，以便于為后續(xù)研究其分子機制及在乳腺癌中的功能做鋪墊。 方法：構建RSK4變異體3（RSK4m3）的過表達慢病毒，穩(wěn)定轉染至乳腺癌MDA-MB-231細胞中，使用蛋白印跡實驗與實時熒光定量PCR檢測變異體的蛋白及mRNA的表達情況，通過質譜鑒定找出互作蛋白。結果：穩(wěn)定轉染后，RSK4變異體的蛋白及mRNA表達水平均上調，質譜結果分析找出與RSK4m3有相互作用的Creb,insulin,Ppp2c等蛋白。結論：RSK4m3可能與Creb,insulin,Ppp2c有直接相互作用關系。

乳腺癌；RSK4;變異體；相互作用蛋白

乳腺癌，一個人們聞之色變的名詞，根據最新的統(tǒng)計數據[1]，在中國每年的新診斷出的乳腺癌病例及死亡病例分別占全球的12.2%和9.6%，這一數值的持續(xù)升高，加速著我們對乳腺癌研究的不斷深入。Berns K[2]及SUN Y[3]等人先后證明了，RSK4是抑制乳腺癌侵襲轉移的重要因子，它能夠抑制乳腺癌細胞的生長并誘導其衰老,但對于其通過mRNA可變剪接作用下行成的RSK4的變異體（RSK4 variants，RSK4m）我們卻知之甚少。RSK4共有3個剪接變異體[3]，RSK4m3為其的第三變異體，缺失第19外顯子的15個堿基和第21外顯子，缺失堿基最多，研究也最有意義。本研究旨在尋找RSK4m3的相互作用蛋白，為今后研究其作用機制及生物學功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）細胞系：人乳腺癌細胞株MDA-MB-231于里蘇（上海）生物技術有限公司購買。

（2）主要試劑：Leibovitz’s L-15培養(yǎng)液于吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司購買；陰性對照病毒CON145及RSK4m3慢病毒過表達載體LVRPS6KA6(9076-2)購于上海吉凱基因化學技術有限公司；β-actin內參和RSK4引物均由華大基因科技服務有限公司合成；抗RSK4抗體和山羊抗兔二抗購自Bioworld公司，GAPDH 抗體及小鼠二抗購于上?？党忌锕?。

1.2 方法

（1）構建RSK4變異體3的過表達慢病毒載體：根據NCBI中RSK4 的cDNA（NM_014496.4）為模板，切除第19外顯子的15個堿基和第21外顯子，通過PCR擴增出RSK4m3的基因，對其進行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。進行搖菌培養(yǎng)后，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，提取RNA進行鑒定。

（2）細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定過表達細胞株的構建：將MDA-MB-231細胞接種至六孔板中，吹打鋪勻，當細胞密度達到70%-80%的時候進行慢病毒轉染，棄上清，放入培養(yǎng)箱。12小時后取出，去上清，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在24,48,72和96小時時觀察熒光蛋白的表達。設計3組，一個未轉染病毒對照組（con組），一個轉染陰性病毒對照組（mock組），一個過表達RSK4m3慢病毒組（OE組）。

（3）實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達

通過Primer5.0設計出β-actin和RSK4m3的引物序列：

β-actin∶ F 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’, R 5’-C T C C T T A A T G T C A C G C A C G A T-3’; R S K 4 m 3∶F 5’-C A G C C A G T G C A A A T G C T C A T C-3’, R 5’-GGAGCCAACACCAATATCCTC-3’。提取細胞總RNA，后逆轉為cDNA。根據SYBR Green 試劑盒進行qRT-PCR檢測。根據數據計算CT值，以2-△△CT來表示mRNA的相對表達量，根據如下計算公式，△CT=CT平均值RSK4-CT平均值actin，△△CT=△CTOE-△CTMOCK。

（4）免疫印跡檢測蛋白表達：在細胞穩(wěn)定轉染72小時后取出，PBS沖洗3遍提取總蛋白，測濃度。用聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，以25ug/孔進行蛋白上樣，跑近膠底后，以15V的恒壓半干轉至PVDF膜，1h后取出封閉，RSK4一抗（1：1000）4°C孵育過夜，TBST清洗3遍，二抗孵育1小時。洗膜后發(fā)光，用BIO-RAD化學發(fā)光儀檢測分析。

（5）質譜（LC-MS/MS）分析：對蛋白樣品進行電泳，后進行考馬斯亮藍染色，取玻璃板，將膠置于板上，切割蛋白條帶所在位置的膠，放入EP管中。加入三蒸水，震蕩10min（700rpm）3次。加入脫色液，振蕩直至無色。后加入三蒸水（1ml）振蕩10min重復3次，使用純乙腈脫水3次。按0.5±0.05ug/ul加入typsin,覆蓋干膠，37℃振蕩過夜。吸取酶解液至新管，將提肽液放入EP管將其覆蓋，超聲振蕩20min，吸出液體與酶解液混合，混勻液置于真空干燥儀，直至完全干燥。樣品除鹽，后進入C18反相柱，以0.5ul/min流速分離，繼而依據設定的線性梯度分離，大于90min.終樣品由LTQ-Orbitrap質譜儀鑒定。

（6）對質譜結果進行生物信息學分析：根據uniprot找出蛋白編號，進行IPA分析并繪制了相應的蛋白—蛋白相互作用網絡圖。

（7）統(tǒng)計學分析：使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行統(tǒng)計分析，結果均以均數`x±s表示，采用t檢驗，p＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

（1）RSK4m3mRNA的表達：PCR結果經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（p=0.024＜0.05,t=6.379）。（圖1）

圖1 轉染細胞中RSK4變異體的mRNA的過表達檢測

（2）RSK4m3的蛋白表達：免疫印跡結果顯示，RSK4蛋白在con組和mock組中表達量極低，僅在轉染了變異體慢病毒的OE組中表達增強。（圖2）

（3）經串聯親和純化后的質譜鑒定及生物學分析：經過分析，我們發(fā)現RSK4m3與Creb,insulin,Ppp2c有相互作用。（圖3）

圖2 rsk4變異體在蛋白水平過表達的檢測

圖3 RSK4變異體相互作用蛋白的網絡分析圖

3 討論

乳腺癌是威脅全球婦女身心健康的重大疾病，每年都有超過100萬的女性患上該病，并且約有41萬人死于次病[4]。RSK4對乳腺腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響，針對該因子的其變異體的研究，我們可以得到新的診斷指標，對乳腺癌的生長速度，惡性程度，發(fā)展趨勢及病程結果預測有更精確的判斷能力，使我們可以根據個體情況制定更有針對性的治療靶點提高治療特異性。

（作者單位：廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院）

[1] 李媛秋. 中國癌癥發(fā)病率預測統(tǒng)計方法研究[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學院,2011.

[2] K B, E H, J M, et al. A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway[J]. Nature,2004(428)∶431-437.

[3] Sun Y, Cao S, Yang M, et al. Basic anatomy and tumor biology of the RPS6KA6 gene that encodes the p90 ribosomal S6 kinase-4[J]. Oncogene,2013,32(14)∶1794-1810.

[4] L Fan，K Strasser-Weippl，Jj Li. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol,2014(15)∶279-289.

田斯琦，女，碩士，研究方向為乳腺癌的臨床與基礎研究。