miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生過程中的表達(dá)*

賀龍梅　趙新華　馬怡茗　汪紅英

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(100021)

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miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生過程中的表達(dá)*

賀龍梅趙新華馬怡茗汪紅英#

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(100021)

背景：miR-181b與多種腫瘤的形成相關(guān)，但其在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌中的表達(dá)情況尚不明確。目的：探索miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生過程中的變化，并初步篩選其下游可能的靶基因。方法：聯(lián)合使用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)制備結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌小鼠模型。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測不同時(shí)期小鼠結(jié)腸組織miR-181b表達(dá)。利用全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan、PicTar和miRDB初步預(yù)測miR-181b的下游靶基因，并以qPCR法檢測結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌小鼠中靶基因的表達(dá)。結(jié)果：miR-181b表達(dá)在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌形成過程中逐漸升高，但單獨(dú)使用AOM或DSS均不會改變miR-181b水平。結(jié)合全基因組表達(dá)譜芯片和miRNA靶基因預(yù)測軟件初步篩選出miR-181b可能的下游靶基因?yàn)镮pmk、E2f5、Klf6、Prkcd、Bai3和Hic2，qPCR法顯示Ipmk、Prkcd、Bai3、Hic2表達(dá)明顯低于對照組。結(jié)論：miR-181b表達(dá)隨結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)展而升高，該變化與單純慢性炎癥無關(guān)。

關(guān)鍵詞miR-181b；結(jié)腸腫瘤；結(jié)腸炎

Expression of miR-181b in Colitis-associated Colon Carcinogenesis

HELongmei,ZHAOXinhua,MAYiming,WANGHongying.

StateKeyLaboratoryofMolecularOncology,NationalCancerCenter/CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing(100021)

Correspondence to: WANG Hongying, Email: hongyingwang@cicams.ac.cn

Background: miR-181b is related to the progression of many tumors, however, its expression in colitis-associated colon cancer is not clear. Aims: To investigate miR-181b expression and its potential target genes in the process of colitis-associated colon carcinogenesis. Methods: Colitis-associated colon cancer model was established by combined administration of azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS) in mice. The expression of miR-181b in colon tissue at different time points was measured by real time fluorescent quantitative PCR (qPCR). Target genes of miR-181b were screened preliminarily by genome microarray combined with miRNA target gene prediction softwares TargetScan, PicTar and miRDB. Expressions of target genes in colitis-associated colon cancer mice were detected by qPCR. Results: The expression of miR-181b was gradually elevated during the development of colitis-associated colon cancer. However, AOM or DSS alone did not change expression of miR-181b. Genome microarray combined with miRNA target gene prediction softwares showed that Ipmk, E2f5, Klf6, Prkcd, Bai3, Hic2 might be the target genes of miR-181b. qPCR showed that expressions of Ipmk, Prkcd, Bai3, Hic2 were significantly decreased in colitis-associated colon cancer than in control group. Conclusions: Expression of miR-181b in colon is upregulated with the development of colitis-associated colon cancer, but is irrelevant with simple chronic inflammation.

Key wordsmiR-181b；Colonic Neoplasms;Colitis

結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均位列世界前五名。炎癥性腸病(IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，是導(dǎo)致結(jié)腸癌的原因之一[1]。結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌是結(jié)腸炎患者的重要死亡原因[2]。結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的臨床研究受諸多因素限制，如患者病理標(biāo)本收集相對困難，難以長期跟蹤獲取同一患者不同時(shí)期的標(biāo)本。因此，動(dòng)物模型成為研究結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展動(dòng)態(tài)過程的重要途徑。目前比較成熟的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌動(dòng)物模型為氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)-葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)模型，可在短期內(nèi)建立慢性結(jié)腸炎相關(guān)的癌變模型[3]。

miRNAs為一種內(nèi)源性非編碼的小RNA，與靶基因mRNA特異性結(jié)合后，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在機(jī)體的生理病理過程中起有重要作用[4-5]。miRNA-181b(miR-181b)在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且其在不同腫瘤中的作用不同。miR-181b通過靶向腫瘤抑制基因TIMP3來促進(jìn)肝癌的發(fā)展[6]；miR-181b通過靶向Bcl2提高胃癌細(xì)胞的耐藥性[7]；在膠質(zhì)瘤中則作為腫瘤抑制基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和侵襲[8-9]。miR-181b表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞株和臨床標(biāo)本中均顯著升高[10-11]，且參與NF-κB介導(dǎo)的血管性炎癥[12]。但miR-181b是否參與炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生未見報(bào)道。本研究通過制備小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型，旨在探討miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)變化，并初步篩選下游可能的靶基因。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級雄性C57BL/6小鼠46只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量18～20 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

2. 主要試劑：AOM購自Sigma公司，DSS購自MP Biomedicals公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，內(nèi)參U6的引物購自廣州復(fù)能基因有限公司，SYBR Green熒光定量PCR試劑購自ABI公司，全基因組表達(dá)譜芯片購自Agilent公司。mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型的建立[13]：將小鼠隨機(jī)分成對照組、AD組、DSS組和AOM組，對照組不作任何處理；AD組第1天(D1)單劑量腹腔注射AOM 12.5 mg/kg，1周后將正常飲用水換為含有2.5% DSS的飲用水，連續(xù)5 d，第12天恢復(fù)正常飲用水持續(xù)16 d，21 d作為一個(gè)DSS周期，共給予3個(gè)周期；DSS組僅給予3個(gè)周期DSS；AOM組僅給予單劑量AOM腹腔注射。各組動(dòng)物飼養(yǎng)71 d后斷頸處死取結(jié)腸組織備用。

2. 動(dòng)物標(biāo)本采集：在每個(gè)DSS周期結(jié)束時(shí)(第29、50、71天)分別處死AD組和對照組小鼠，每組5～7只，分別命名為AD1、AD2、AD3組和對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，取相應(yīng)結(jié)腸組織，-80 ℃冰箱保存。上端結(jié)腸部分命名為ADn-A/Cn-A，下端結(jié)腸部分命名為ADn-D/Cn-D。

3. 熒光定量PCR(qPCR)檢測miR-181b表達(dá)：將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green熒光定量PCR檢測miR-181b表達(dá)，引物序列：AAC ATT CAT TGC TGT CGG TG，具體步驟按試劑盒說明書操作。

4. miR-181b下游靶基因的篩選：①全基因組表達(dá)譜芯片檢測：按照說明書操作，用檢測合格的純化RNA行芯片實(shí)驗(yàn)，掃描芯片獲取圖像，F(xiàn)eature Extraction將圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)值，再用GeneSpring軟件分析數(shù)據(jù)。

②靶基因的預(yù)測：聯(lián)合應(yīng)用miRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan、PicTar和miRDB，取分析結(jié)果交集的100個(gè)基因作為備選集。然后利用全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，分析備選集中100個(gè)可能的靶基因在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生過程中的變化趨勢，選取AD3組中表達(dá)較對照組下調(diào)大于1.5倍的基因。

5. qPCR法驗(yàn)證下游靶基因表達(dá)：按Trizol試劑說明書提取結(jié)腸組織中的總RNA，檢測其濃度和純度。目的基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，qPCR法檢測各基因表達(dá)，具體步驟按試劑盒說明書操作。

表1　PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、miR-181b表達(dá)

AD3組多數(shù)小鼠(6/7)肉眼可見結(jié)腸腺瘤，且腫瘤集中于結(jié)腸中下部(直腸端)；而其他各組包括AD1、AD2、DSS和AOM組均未發(fā)現(xiàn)腫瘤。HE染色示AD3組小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)腺瘤樣特征(圖1)。

A：對照組；B：AD3組

與對照組(2.03±0.48)相比，AD2、AD3組腫瘤好發(fā)的下端結(jié)腸miR-181b表達(dá)逐漸升高(28.61±6.37和61.95±17.74)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，AD1組(7.04±4.15)無明顯差異；而在不易發(fā)生腫瘤的上端結(jié)腸，各組miR-181b表達(dá)未發(fā)生明顯變化(圖2)。提示miR-181b表達(dá)升高與結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

**P<0.01

圖2miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型發(fā)生過程中的表達(dá)變化

二、miR-181b表達(dá)與DSS引起的慢性炎癥的關(guān)系

DSS組(1.57±0.72)和AOM組(1.51±0.14)miR-181b表達(dá)與對照組(2.03±0.48)相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于AD3組(61.95±17.74)(P<0.05)(圖3)。說明miR-181b表達(dá)與DSS引起的慢性炎癥和AOM引起的DNA突變致癌作用無直接關(guān)系。

三、miR-181b靶基因的預(yù)測

最終確定Ipmk、E2f5、Klf6、Prkcd、Bai3、Hic2作為備選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證(圖4)。同時(shí)，對已報(bào)道的miR-181b靶基因在基因組芯片中的表達(dá)趨勢進(jìn)行分析，結(jié)果顯示部分靶基因在結(jié)腸炎癌變過程中呈下降趨勢，如Timp3、Ulk3和Snx25等(圖5)。

四、qPCR檢測預(yù)測靶基因的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，AD3組中Ipmk、Bai3、Hic2和Prkcd表達(dá)明顯低于對照組(圖6)，與全基因組表達(dá)譜芯片的結(jié)果一致。其中Bai3基因表達(dá)下調(diào)最為顯著。

*P<0.05，**P<0.01

圖4全基因組表達(dá)譜芯片中表達(dá)下調(diào)的miR-181b預(yù)測靶基因

圖5部分已知的miR-181b靶基因在全基因組表達(dá)譜芯片中下調(diào)

圖6　qPCR驗(yàn)證潛在靶基因的表達(dá)

討論

結(jié)腸癌的高遷移率和復(fù)發(fā)率以及抗藥性均為其治療療效的障礙[14]。臨床研究顯示miR-181b在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，且與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[15-16]。本研究利用動(dòng)物模型模擬了結(jié)腸癌的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，彌補(bǔ)了臨床樣本的不足。結(jié)果顯示miR-181b在腫瘤發(fā)生中呈逐漸升高的趨勢，進(jìn)一步證實(shí)miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要性。此外，miR-181b在腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞中均可見表達(dá)[17-20]，但炎癥相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生中miR-181b的細(xì)胞來源及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

miRNA靶向抑制抑癌基因表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一，通過抑制不同的下游靶基因來調(diào)節(jié)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能[4]。抑癌基因Bai3作為膜受體蛋白，主要參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生[21]。最近研究發(fā)現(xiàn)Bai3在其他腫瘤中亦發(fā)揮重要作用，如小細(xì)胞肺癌[22]。本實(shí)驗(yàn)中，AD3組小鼠結(jié)腸中Bai3表達(dá)顯著下降，提示Bai3作為miR-181b可能的下游靶基因參與了結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生，為結(jié)腸癌的研究提供了新方向。

此外，多項(xiàng)研究[23-24]發(fā)現(xiàn)miR-181b高表達(dá)的結(jié)腸癌患者對S-1(由替加氟、吉美嘧啶和氧嗪酸鉀以 1∶0.4∶1 的比例構(gòu)成的復(fù)合藥物)顯示出較強(qiáng)的耐藥性，但具體機(jī)制并不明確。Hic2作為潛在的miR-181b靶基因，其低表達(dá)可明顯增加癌細(xì)胞的抗藥性[25]，但在結(jié)腸癌中目前未見相關(guān)報(bào)道。因此，AD3組中Hic2表達(dá)下降可能參與了結(jié)腸癌的耐藥性調(diào)節(jié)，但該假設(shè)需行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-181b表達(dá)變化與DSS引起的慢性炎癥本身無關(guān)。最近研究提示miR-181b-1表達(dá)受STAT3調(diào)控[26]。STAT3是炎癥因子IL-6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在結(jié)腸炎癌變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[27]。因此，miR-181b表達(dá)在小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中逐漸升高，可能與IL-6/STAT3信號相關(guān)，為miR-181b促進(jìn)結(jié)腸炎癌變的研究提供了新依據(jù)。

生物信息學(xué)分析顯示miR-181b啟動(dòng)子區(qū)含有p53結(jié)合位點(diǎn)[10]，且p53表達(dá)在AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型中逐漸升高[28]。提示p53可能參與結(jié)腸炎癌變過程中miR-181b表達(dá)上調(diào)。另一方面，本研究預(yù)測的miR-181b靶基因之一Ipmk是一個(gè)多功能的蛋白激酶[29]，可與p53結(jié)合介導(dǎo)其去乙?；?，增強(qiáng)p53活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。因此本研究提示p53與miR-181b之間的正循環(huán)可能參與并促進(jìn)了結(jié)腸炎的癌變過程。

綜上所述，miR-181b在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，其具體促進(jìn)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制、是否可能作為結(jié)腸癌患者診斷或預(yù)后評估的標(biāo)記物，以及作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性還需行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。

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(2015-09-22收稿；2015-10-12修回)

*基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃(91129717)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.04.004

#本文通信作者，Email: hongyingwang@cicams.ac.cn