基于Keap1-Nrf2-ARE通路維持黏膜屏障完整探討舒胃湯防治胃潰瘍的研究

張　琪，梁海業(yè)，陳世新，張　濤

(1. 廣西桂平市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂平 537200；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

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基于Keap1-Nrf2-ARE通路維持黏膜屏障完整探討舒胃湯防治胃潰瘍的研究

張琪1，梁海業(yè)1，陳世新1，張濤2

(1. 廣西桂平市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂平 537200；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

[摘要]目的通過觀察胃潰瘍患者治療前后Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Keap1-Nrf2-ARE)通路中相關(guān)指標(biāo)及胃黏膜超微結(jié)構(gòu)變化，探討舒胃湯防治胃潰瘍可能機制。方法采用自身前后歷史對照設(shè)計，選擇符合診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)的胃潰瘍患者30例，予舒胃湯連續(xù)干預(yù)6周，應(yīng)用透射電鏡觀察治療前后胃黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測Keap1、Nrf2、ARE基因表達(dá)情況，應(yīng)用免疫組化法檢測ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果治療前，電鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞微絨毛稀疏甚至脫落消失，細(xì)胞間復(fù)合連接松解消失，核固縮，出現(xiàn)核周隙，異染色質(zhì)塊狀分布于核膜下；線粒體腫脹變大，嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞處于壞死期，存在細(xì)胞大量自噬現(xiàn)象。治療后，電鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞體積明顯變小，核染色質(zhì)邊集、核固縮，核膜斷核碎裂，細(xì)胞器明顯擴(kuò)張腫脹、碎裂，空泡化，凋亡小體形成，亦存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象。治療后，患者胃黏膜組織中Keap1、Nrf2、ARE表達(dá)水平，ZO-1及Occulidin蛋白陽性分布面積均明顯高于治療前(P均<0.05)。結(jié)論舒胃湯可能通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE通路，減少氧化應(yīng)激損傷，上調(diào)ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)，促進(jìn)黏膜屏障修復(fù)而發(fā)揮防治胃潰瘍的作用。

[關(guān)鍵詞]Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1；核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2；氧化反應(yīng)；黏膜屏障；胃潰瘍；舒胃湯

現(xiàn)階段，“提高黏膜愈合質(zhì)量，減少潰瘍復(fù)發(fā)”是消化性潰瘍防治的重要目標(biāo)[1]。前期課題組在廣西衛(wèi)生廳課題資助下初步證實舒胃湯具有明確防治消化性潰瘍的臨床效用，與四聯(lián)療法聯(lián)用可提高幽門螺桿菌根除率及黏膜愈合質(zhì)量，其機制可能與延緩上皮細(xì)胞凋亡，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-3及Ghrelin表達(dá)相關(guān)[2-4]。盡管目前“無酸則無潰瘍”理念已被廣泛接受，但是不可否認(rèn)免疫相關(guān)損傷以及氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(ROS)直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，均可導(dǎo)致胃黏膜屏障破壞及胃黏膜修復(fù)障礙，引起靶器官損傷。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件通路(Keap1-Nrf2-ARE)調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，介導(dǎo)ZO-1及Occludin蛋白釋放，對維持胃黏膜緊密連接具有重要作用[5-6]，課題組基于前期工作基礎(chǔ)，采用自身前后歷史對照設(shè)計，觀察了舒胃湯治療前后胃黏膜超微結(jié)構(gòu)、Keap1-Nrf2-ARE通路中相關(guān)指標(biāo)及ZO-1蛋白、Occludin蛋白表達(dá)情況，旨在探討舒胃湯防治胃潰瘍的可能機制。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2014年1月—2015年1月在桂平市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診胃潰瘍患者30例，均符合《中醫(yī)內(nèi)科常見疾病診療指南·西醫(yī)疾病部分》中消化性潰瘍辨證分型章節(jié)關(guān)于肝胃郁熱診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均為單純性胃潰瘍，無并發(fā)癥，年齡18～65歲，能理解和簽署知情同意書。排除有嚴(yán)重肝腎功能不全、心肺功能不全及精神疾病患者，孕婦或近3個月有意懷孕者。其中男14例，女16例；年齡(37.23±11.16)歲；病程(2.45±1.12)個月。

1.2試劑與儀器Olympus內(nèi)鏡操作系統(tǒng)(260)，電鏡固定液、10%中性福爾馬林購自上海玉森生物試劑公司，Keap1、Nrf2及ARE引物設(shè)計與合成委托廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司，ZO-1、Occludin蛋白一抗購自美國Santa公司，二抗購自武漢博士德公司。ABI7500熒光定量PCR儀、H-600透射電鏡以及低溫高速離心機均由廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司提供。Keap1、Nrf2、ARE及GAPDH引物序列見表1。

1.3治療方法采用自身前后歷史對照設(shè)計，所有患者均給予舒胃湯口服。組方：柴胡10 g、白芍12 g、枳殼10 g、甘草6 g、厚樸10 g、砂仁6 g、蒲公英15 g、石斛15 g、郁金12 g、川楝子6 g、延胡索12 g、蘆根15 g。均為免煎中藥，購自本院藥房，由江蘇江陰天江制藥有限公司生產(chǎn)。每天1劑，分2次服，連續(xù)6周。

表1　Keap1、Nrf2、ARE及GAPDH引物序列

注：在Gen Bank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1胃黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮細(xì)胞變化分別于治療前后采用透射電鏡(H-600)觀察胃黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮細(xì)胞凋亡、壞死及自噬情況，實驗步驟嚴(yán)格按照電鏡操作說明進(jìn)行。

1.4.2胃黏膜Keap1-Nrf2-ARE通路中相關(guān)指標(biāo)變化分別于治療前后應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE mRNA表達(dá)變化，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，該工作委托廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院完成。

1.4.3胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)變化分別于治療前后應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)變化，以PBS為陰性對照替代一抗，以細(xì)胞核或膜棕黃色染為陽性，采用image pro-plus6.0進(jìn)行圖像分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1治療前后胃黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化治療前，胃潰瘍患者電鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞微絨毛稀疏甚至脫落消失，細(xì)胞間復(fù)合連接松解消失，核固縮，出現(xiàn)核周隙，異染色質(zhì)塊狀分布于核膜下；線粒體腫脹變大，嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞處于壞死期，存在細(xì)胞大量自噬現(xiàn)象。治療后，胃潰瘍患者電鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞體積明顯變小，核染色質(zhì)邊集、核固縮，核膜斷核碎裂，細(xì)胞器明顯擴(kuò)張腫脹、碎裂，空泡化，凋亡小體形成，亦存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象。見圖1和圖2。

圖1　治療前胃黏膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(×12 000)

2.2治療前后胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)變化治療后，胃潰瘍患者胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)均明顯高于治療前(P均<0.05)。見表2。

圖2　治療后胃黏膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(×12 000)

時間nKeap1Nrf2ARE治療前300.98±0.121.04±0.090.87±0.10治療后301.68±0.11①1.97±0.14①1.85±0.09①

注：①與治療前比較，P<0.05。

2.3治療前后胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)變化治療前，胃黏膜ZO-1及Occulidin蛋白陽性分布面積分別為(2 026.56±321.78)μm3、(2 432.43±278.76)μm3；治療后，胃黏膜ZO-1及Occulidin蛋白陽性分布面積分別為(4 571.43±268.97)μm3、(4 328.91±376.51)μm3。治療前后比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3討論

晚近20年“無酸則無潰瘍”的理念已經(jīng)為消化界廣為接受，但是胃潰瘍的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率未見明顯下降，僅有胃潰瘍并發(fā)癥的發(fā)生率和手術(shù)率已明顯下降。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)失調(diào)，基于模式識別受體與風(fēng)險相關(guān)因子信號在該反應(yīng)中占據(jù)重要地位，其中ROS直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃黏膜受損的可能機制之一。生理情況下，機體有一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)，當(dāng)暴露于親電子試劑或活性氧刺激時，能誘導(dǎo)出一系列的保護(hù)性蛋白，以緩解細(xì)胞所受的損害[8]。Nrf2是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，含有6個高度保守的結(jié)構(gòu)域Neh(Nrf2-ECH homology)，分別被命名為Nehl-Neh6[9]。Nehl區(qū)包含1個C端亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)bZip(basic leucime zipper)，bZip與細(xì)胞核內(nèi)小Maf蛋白(small Maf proteins)形成異二聚體，使Nrf2能夠識別、結(jié)合ARE，從而啟動目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。Neh1區(qū)是Nrf2與胞漿蛋白Keap1結(jié)合區(qū)，含有ETGE基序、DLG基序兩個結(jié)合位點。當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞核的Nrf2以Nrf2-Maf的形式與ARE結(jié)合后并不能立即啟動轉(zhuǎn)錄，尚需要其他輔助蛋白如CREB結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄激活劑與Nrf2的Neh4，Neh5兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合后才能啟動轉(zhuǎn)錄過程[10]。Keap1是Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合蛋白，并與肌動蛋白結(jié)合錨定于胞漿中，含有5個結(jié)構(gòu)域，分別為N端結(jié)構(gòu)域(NTR)、干預(yù)區(qū)(IVR)、BTB區(qū)、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)(DGR)和C端結(jié)構(gòu)域(CTR)。其中DGR區(qū)也叫Kelch區(qū)，是Keap1與Nrf2的結(jié)合區(qū)，同時也是與胞漿內(nèi)肌動蛋白結(jié)合的位點[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前胃潰瘍患者胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)上升，電鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞稀疏，細(xì)胞壞死，及細(xì)胞自噬；治療后胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)下降，電鏡下胃黏膜上皮細(xì)胞體積明顯變小，核染色質(zhì)邊集、核固縮，核膜斷核碎裂，細(xì)胞凋亡及自噬。舒胃湯可能通過下調(diào)Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)，改善胃黏膜上皮超微結(jié)構(gòu)的效用。

舒胃湯具有促進(jìn)上皮細(xì)胞修復(fù)、改善胃黏膜屏障的作用，維持胃黏膜屏障完整對于潰瘍治愈是非常重要的一環(huán)。胃黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接(Tight junction，TJ)是胃黏膜屏障的重要組成部分，它位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面，具有維持細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)滲透性2個主要功能，主要由閉鎖(Occludin)蛋白、zonula occludens(ZOs)蛋白、Claudin蛋白以及連接黏附分子(JAM)等組成[13]。Occludin及Claudin是跨膜蛋白，其細(xì)胞外的部分與相鄰細(xì)胞間的跨膜連接蛋白互相作用，封閉細(xì)胞間隙，其細(xì)胞內(nèi)的部分則與ZOs(ZO-1，2，3)相連；ZOs屬于胞漿蛋白，把Occludin蛋白和肌動蛋白骨架連接在一起，形成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前胃潰瘍患者胃黏膜ZO-1、Occuldin蛋白表達(dá)下降，治療后胃黏膜ZO-1、Occuldin蛋白表達(dá)上升。舒胃湯具有明確上調(diào)ZO-1、Occuldin蛋白表達(dá)，修復(fù)腸黏膜屏障的作用。

綜上所述，舒胃湯具有明確緩解胃潰瘍的效用，其療效可能與上調(diào)Keap1、Nrf2及ARE表達(dá)，清除氧自由基，上調(diào)ZO-1、Occuldin蛋白表達(dá)，促進(jìn)黏膜修復(fù)相關(guān)。

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Study on Shuwei decoction prevention and treatment of gastric ulcer by regulating Keap1-Nrf2-ARE signal pathway to maintain the integrity of gastric mucosa

ZHANG Qi1, LIANG Haiye1, CHEN Shixin1, ZHANG Tao2

(1. The TCM Hospital of Guiping City,Guiping 537200, Guangxi, China;2. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of TCM,Nan ning 530011， Guangxi, China)

Abstract:Objective It is to explore the prevention and treatment mechanism of Shuwei decoction on gastric ulcer by observing the changes of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway and the ultra structural in gastric mucosa before and after treatment. Methods It was a history control design trial. Thirty patients who conformed to diagnostic criteria, inclusion criteria and exclusion criteria were treated with Shuwei decoction for 6 weeks. The gastric mucosa ultra structure and apoptosis of epithelial cells were observed by electron microscope.The Keap1, Nrf2 ARE gene expression was detected by the fluorescence quantitative PCR. The expression of Occludin and ZO-1 protein was detected by immunohistochemistry. Results Before treatment, gastric ulcer patients under electron microscope visible gastric mucosa epithelial microvillus sparse even shedding vanished, intercellular composite connections were loose or disappeared, nuclear pyknosis, nuclear week gaped, heterochromatin block distribution under nuclear membrane; mitochondrial swelling became larger, cristae fractured; rough endoplasmic reticulum expanded, cells were in the necrotic phase, there were a large number of cells autophagy.After treatment, gastric ulcer patients under electron microscope visible gastric mucosa epithelial cell volume became small, nuclear chromatin margination, nuclear pyknosis, nuclear membrane broken nuclear fragmentation, organelles marked dilation of the swelling, fragmentation, vacuolization, formation of apoptotic bodies, autophagy was also found.After treatment,the levels of Keap1, Nrf2, ARE expressions in gastric mucosa tissue, the positive distribution of ZO-1 and Occulidin protein were significantly higher than that before treatment(P<0.05). Conclusion Shuwei decoction exerts a distinct effect on curing gastric ulcer by regulating Keap1-Nrf2-ARE pathway, reducing oxidative stress injury, up-regulating the expression of ZO-1 and Occludin protein.

Key words:Kelch-like ECH-associated protein1; nuclear factor erythroid 2-related factor 2; antioxidant response；mucosal barrier；gastric ulcer; Shuwei decoction

[收稿日期]2016-01-05

[中圖分類號]R573.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)13-1395-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.009

[作者簡介]張琪，女，副主任中醫(yī)師，主要從事消化性潰瘍中醫(yī)藥防治。[通信作者]張濤，E-mail：398080200@qq.com