白藜蘆醇對體外卵巢癌SKOV3細胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用

李　研

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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白藜蘆醇對體外卵巢癌SKOV3細胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用

李研

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的研究白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對體外人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用及其機制。方法將對數生長期的人上皮性卵巢癌SKOV3細胞隨機分為空白組，白藜蘆醇40，20，10 μg/mL干預組和順鉑40 μg/mL干預組。干預48 h后，通過光學顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)，四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞增殖抑制率；通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況并計算凋亡率。采用右側背部皮下注射接種人上皮性卵巢癌SKOV3細胞的方法制備荷人上皮性卵巢癌裸小鼠模型，將50只造模成功小鼠隨機分為模型組，白藜蘆醇200，100，50 mg/kg組和順鉑組，模型組灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應藥物，隔天1次。灌胃5次后處死動物取腫瘤組織，稱瘤質量并計算抑瘤率；通過HE染色觀察腫瘤組織病理形態(tài)學變化；通過免疫組織化學法觀察腫瘤組織中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達情況并進行半定量分析，計算bax/bcl-2比值。結果在體外，白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖，且白藜蘆醇40 μg/mL干預組細胞增殖抑制率和凋亡率均最高。在體內，白藜蘆醇200，100 mg/kg組和順鉑組瘤質量顯著低于模型組(P均<0.05)，且白藜蘆醇各組抑瘤率呈劑量依賴性升高(P均<0.05)；順鉑組和白藜蘆醇200，100 mg/kg組腫瘤組織中bcl-2表達量明顯低于模型組(P均<0.05)，caspase-3表達量明顯高于模型組(P均<0.05)；各給藥組bax表達量和bax/bcl-2比值均明顯高于模型組(P均<0.05)。結論白藜蘆醇對體外人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長均具有抑制作用，其作用機制可能與白藜蘆醇能夠有效下調bcl-2蛋白表達、上調bax和caspase-3蛋白表達、提高bax/bcl-2比值有關。

[關鍵詞]白藜蘆醇；卵巢癌；SKOV3；移植瘤

卵巢癌致死率高居婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅著女性的生命健康。通過徹底細胞減滅術和術后聯合紫杉醇、鉑類等一線化療藥物進行綜合治療，3年內復發(fā)率仍高于50%，5年生存率仍不到30%[1]。因此，迫切需要研發(fā)新型的抗癌藥物以及新的治療方案。白藜蘆醇是一種天然存在的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、降糖調脂等多種藥理學作用[2-4]。通過動物實驗研究發(fā)現，白藜蘆醇能夠有效抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡[5]；白藜蘆醇對肝癌也具有一定的治療作用[6]。本實驗通過白藜蘆醇干預人上皮性卵巢癌SKOV3細胞，并制備荷人上皮性卵巢癌SKOV3細胞裸小鼠模型，以順鉑為陽性對照，研究白藜蘆醇對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1細胞和動物人上皮性卵巢癌SKOV3細胞由河北醫(yī)科大學病理學教研室惠贈；雌性Balb/C裸小鼠(4～6周齡，體質量18～22 g)購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(SLAC)，許可證號：SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2藥物與試劑白藜蘆醇(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：140125，純度≥98%)；順鉑(山東齊魯制藥有限公司，10 mg/支)；二甲基亞楓(DMSO，美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑鹽試劑盒(MTT，美國Sigma公司)；Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(德國Bendermed公司)；bcl-2、bax、caspase-3免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3主要儀器超凈工作臺(蘇州凈化設備一廠)；HF90/HF240 CO2細胞培養(yǎng)箱(香港Heal Force公司)；酶標儀(美國 BIO-RAD公司)；PCR儀(武漢新未來儀器技術有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(德國SLEE公司)；分析天平(上海天平儀器廠)。

1.4體外實驗

1.4.1細胞培養(yǎng)與分組將人上皮性卵巢癌SKOV3細胞株經解凍復蘇后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長至對數生長期，去培養(yǎng)液后用0.25%胰酶消化，然后用培養(yǎng)液調整細胞密度為5×107L-1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后隨機分為空白組，白藜蘆醇40，20，10 μg/mL干預組和順鉑40 μg/mL干預組，各干預組加入相應藥物干預48 h。

1.4.2細胞形態(tài)學觀察干預48 h后，通過倒置光學顯微鏡觀察并比較各組細胞形態(tài)差異。

1.4.3細胞增殖抑制率測定干預48 h后，調整細胞濃度為5×107L-1，接種于96孔板，每組設10個復孔，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)平培養(yǎng)4 h后去上清，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min后通過酶標儀測定波長570 nm處每組細胞吸光度(OD)值，然后通過OD值計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.4.4細胞凋亡狀況及凋亡率檢測藥物干預48h 后，取約1×106個細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗滌，加70%乙醇5 mL混勻，于4 ℃環(huán)境放置48 h后，離心去除乙醇，PBS洗滌，用約1 mL PBS溶液打散細胞團后加水解酶Rnase 5 μL(10 mg/mL)，37 ℃環(huán)境放置1 h后加入碘化丙啶(100 μg/mL)染液，室溫避光孵育30 min，然后通過FACS-FITC和PI聯合染色流式細胞儀進行分析檢測，采用CELL Quest軟件分析各組細胞凋亡狀況并計算細胞凋亡率。

1.5體內實驗

1.5.1動物模型制備與分組將對數生長期卵巢癌SKOV3細胞調整濃度為2×1010L-1，無菌條件下注射接種于裸鼠右側背部皮下，每只接種量0.2 mL，7 d后出現>100 mm3皮下結節(jié)即認為造模成功。將50只造模成功裸小鼠隨機分為模型組，白藜蘆醇200，100，50 mg/kg組和順鉑組(2 mg/kg)；模型組灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應藥物，隔天灌胃1次，共灌胃5次。

1.5.2瘤質量測定及抑瘤率的計算末次灌胃后24 h頸椎脫臼處死小鼠，剖取腫瘤組織，通過電子天平稱量腫瘤組織質量，計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。

1.5.3腫瘤組織病理形態(tài)學觀察將所取腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，經石蠟包埋、切片、展片處理后，進行常規(guī)HE染色，最后通過光學顯微鏡觀察腫瘤組織病理形態(tài)學變化。

1.5.4腫瘤組織中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達的檢測及半定量分析取制備好的組織石蠟切片，按照試劑盒操作方法步驟，通過免疫組織化學法檢測腫瘤組織中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達情況，然后進行半定量分析：每張染色切片隨機選取6個視野，通過BI-2000醫(yī)學圖像分析軟件測定平均光密度(OD)，取平均值，然后根據bcl-2、bax表達OD值計算bax/bcl-2比值。

2結果

2.1各組SKOV3細胞形態(tài)顯微鏡下觀察發(fā)現：空白組SKOV3細胞貼壁生長狀態(tài)良好；而各給藥組SKOV3細胞呈現皺縮、形態(tài)變圓、數量減少、部分脫落等現象，該現象以白藜蘆醇40 μg/mL干預組最為顯著。見圖1～5。

圖1空白組SKOV3細胞形態(tài)

圖2白藜蘆醇10 μg/mL干預組SKOV3細胞形態(tài)

圖3白藜蘆醇20 μg/mL干預組SKOV3細胞形態(tài)

圖4白藜蘆醇40 μg/mL干預組SKOV3細胞形態(tài)

2.2各組SKOV3細胞增殖抑制率空白組SKOV3細胞增殖抑制率為0，順鉑40 μg/mL干預組為(43.05±5.92)%，白藜蘆醇10 μg/mL干預組為(28.01±6.25)%，白藜蘆醇20 μg/mL干預組為(42.58±7.90)%，白藜蘆醇40μg/mL干預組為(67.845±8.67)%。白藜蘆醇各組細胞增殖抑制率40 μg/mL干預組>20 μg/mL干預組>10 μg/mL干預組, 差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；白藜蘆醇40 μg/mL干預組細胞增殖抑制率顯著高于順鉑干預組(P<0.05)。

圖5順鉑40 μg/mL干預組SKOV3細胞形態(tài)

2.3各組SKOV3細胞凋亡狀況空白組SKOV3細胞凋亡率為(1.97±1.24)%，順鉑40 μg/mL干預組為(38.15±5.68)%，白藜蘆醇10 μg/mL干預組為(15.29±4.72)%，白藜蘆醇20 μg/mL干預組為(44.61±7.80)%，白藜蘆醇40 μg/mL干預組為(73.27±9.34)%。各給藥組SKOV3細胞凋亡率均明顯高于空白組(P均<0.05)；白藜蘆醇各組細胞凋亡率40 μg/mL干預組>20 μg/mL干預組>10 μg/mL干預組, 差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；白藜蘆醇40 μg/mL干預組細胞凋亡率顯著高于順鉑干預組(P<0.05)。

2.4各組裸小鼠瘤質量和抑瘤率比較白藜蘆醇200，100 mg/kg組和順鉑組瘤質量顯著低于模型組(P均<0.05)，且白藜蘆醇各組抑瘤率呈劑量依賴性升高(P均<0.05)。見表1。

表1　各組裸小鼠瘤質量和抑瘤率比較±s)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與白藜蘆醇200 mg/kg組比較，P<0.05；③與白藜蘆醇100 mg/kg組比較，P<0.05。

2.5各組裸小鼠腫瘤組織形態(tài)學表現模型組荷人上皮性卵巢癌SKOV3細胞呈橢圓形，胞質飽滿，胞核增大呈2個或多個，核仁深染；白藜蘆醇各組和順鉑組腫瘤細胞呈現皺縮、核染色質邊集，并出現不同程度的片狀壞死區(qū)，以白藜蘆醇200 mg/kg組最為顯著。見圖6～10。

2.6各組裸小鼠腫瘤組織bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達情況及bax/bcl-2比值順鉑組和白藜蘆醇200，100 mg/kg組腫瘤組織中bcl-2表達量明顯低于模型組(P均<0.05)，caspase-3表達量明顯高于模型組(P均<0.05)，其中白藜蘆醇200 mg/kg組效果最為顯著；各給藥組bax表達量和bax/bcl-2比值均明顯高于模型組(P均<0.05)，白藜蘆醇200mg/kg組bax/bcl-2比值顯著高于順鉑組(P<0.05)。見表2。各組裸小鼠腫瘤組織bcl-2、bax、caspase-3蛋白IHC染色表現見圖11～25。

圖6　模型組腫瘤組織形態(tài)學表現(HE)

圖7　白藜蘆醇200 mg/kg組腫瘤組織形態(tài)學表現(HE)

圖8　白藜蘆醇100 mg/kg組腫瘤組織形態(tài)學表現(HE)

圖9　白藜蘆醇50 mg/kg組腫瘤組織形態(tài)學表現(HE)

圖10　順鉑組腫瘤組織形態(tài)學表現(HE)

表2　各組裸小鼠腫瘤組織bcl-2、bax、caspase-3表達

注：①與模型組比較，P<0.05；②與白藜蘆醇200 mg/kg組比較，P<0.05；③與順鉑組比較，P<0.05。

圖11　模型組腫瘤組織bcl-2蛋白表達表現(IHC)

圖12　白藜蘆醇200 mg/kg組腫瘤組織bcl-2蛋白表達圖(IHC)

圖13　白藜蘆醇100 mg/kg組腫瘤組織bcl-2蛋白表達圖(IHC)

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第2位；由于早期診斷率低，年病死率約9.5/10萬，居婦科惡性腫瘤之首[7]。目前，對于卵巢癌的治療主要以手術切除聯合術后化療為主，雖能暫時清除并抑制腫瘤細胞，但易復發(fā)，其中腫瘤細胞耐藥性的產生是導致化療失敗和腫瘤復發(fā)的主要原因之一[1]。

圖14　白藜蘆醇50 mg/kg組腫瘤組織bcl-2蛋白表達圖(IHC)

圖16　模型組腫瘤組織bax蛋白表達圖(IHC)

圖17　白藜蘆醇200 mg/kg組腫瘤組織bax蛋白表達圖(IHC)

圖18　白藜蘆醇100 mg/kg組腫瘤組織bax蛋白表達圖(IHC)

圖19　白藜蘆醇50 mg/kg組腫瘤組織bax蛋白表達圖(IHC)

圖20　順鉑2 mg/kg組腫瘤組織bax蛋白表達圖(IHC)

圖21　模型組腫瘤組織caspase-3蛋白表達圖(IHC)

圖22　白藜蘆醇200 mg/kg組腫瘤組織caspase-3蛋白表達圖(IHC)

圖23　白藜蘆醇100 mg/kg組腫瘤組織caspase-3蛋白表達圖(IHC)

圖24　白藜蘆醇50 mg/kg組腫瘤組織caspase-3蛋白表達圖(IHC)

圖25　順鉑組腫瘤組織caspase-3蛋白表達圖(IHC)

白藜蘆醇是一種具有多種藥理學活性的多酚類化合物。Lee等[8]研究發(fā)現，白藜蘆醇在致癌期及癌癥早期、發(fā)展期、轉移期等癌癥發(fā)生發(fā)展的各個階段均具有抑制作用。鄭麗維等[5]通過動物實驗研究發(fā)現，白藜蘆醇有延緩胃癌進展的作用。趙丹懿等[9]研究發(fā)現，白藜蘆醇能夠下調bcl-2蛋白表達并上調細胞因子IL-2、IL-6、IL-12及TNF-α的表達，表現出對肝癌細胞Bel-7402增殖的抑制作用。本實驗通過白藜蘆醇體外干預人上皮性卵巢癌SKOV3細胞進行研究發(fā)現，白藜蘆醇能夠影響SKOV3細胞生長，顯著提高其增殖抑制率和凋亡率。體內實驗研究發(fā)現，白藜蘆醇能夠抑制荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生長，顯著提高抑瘤率；觀察組織病理切片發(fā)現，白藜蘆醇還能夠誘導腫瘤組織細胞壞死。提示白藜蘆醇對體外人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生長均具有抑制作用。

bcl-2家族基因在細胞凋亡過程中起著非常重要的調節(jié)作用，其中bcl-2和bax是非常重要的成員，bcl-2為凋亡抑制基因，而bax為促凋亡基因，兩者間相互作用、共同調控細胞凋亡[10]；進一步研究發(fā)現，細胞凋亡不僅與2種基因的表達密度有關，甚至更依賴于bcl-2/bax比值[11]。caspases基因家族參與細胞凋亡啟動、執(zhí)行整個過程的調節(jié)，其中

caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶。本研究結果顯示，白藜蘆醇能夠顯著下調荷人上皮性卵巢癌裸小鼠腫瘤組織bcl-2蛋白表達，上調bax和caspase-3蛋白表達，提高bax/bcl-2比值，這可能是白藜蘆醇抑制荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的重要機制之一。

綜上所述，白藜蘆醇具有抑制體外人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖及體內荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生長的作用，其作用機制可能與白藜蘆醇能夠有效下調bcl-2 蛋白表達、上調bax和caspase-3蛋白表達、提高bax/bcl-2比值有關。

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Inhibition effects of resveratrol on SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice

LI Yan

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the inhibition effects of resveratrol(Res) on SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice. Methods The SKOV3 cells of epithelial ovarian cancer were divided randomly into five groups: normal control group, Res(40, 20, 10 μg/mL) groups and Cisplatin 40 μg/mL group. After intervention for 48 h, the cell morphology were observed by optical microscope, the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, the apoptosis rate were analyzed by flow cytometry. Fifty nude mice models bearing human ovarian cancer were made by injecting inoculation human epithelial ovarian cancer cell line SKOV3 and were divided randomly into five groups: model control group, Res(200, 100, 50 mg/kg) groups and Cisplatin 2 mg/kg group, the drugs were given by intragastric administration(ig) for 5 times. The tumor weight was detected and the inhibition rate was calculated; the histopathological changes of tumor tissue was observed by HE staining; the expression of bcl-2, bax, caspase-3 were detected by IHC and were Semi-quantitative analyzed. Results Compared with normal control group, the morphological of Res(40, 20 μg/mL) groups were abnormalities, the cellular growth inhibition rate was significantly increased(P<0.01), the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01). Compared with model control group, the tumor weight of Res (200, 100 mg/kg) groups were significantly decreased and the inhibition rate were significantly increased(P<0.05, P<0.01); necrosis presentation, tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared in Res (200, 100 mg/kg) groups; the expression of bcl-2 were significantly decreased, the expression of bax were significantly increased, and the ratio of bax/bcl-2 were significantly increased(P<0.01), the expression of caspase-3 protein were significantly increased(P<0.05, P<0.01). Conclusion Res could effectively inhibit SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice, and the mechanism may be related with its down-regulating the expression of bcl-2 and up-regulating the expression of bax and caspase-3, increasing bax/bcl-2 value.

Key words:resveratrol; ovarian cancer; SKOV3; xenografts

[收稿日期]2015-05-16

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)02-0135-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.007

[作者簡介]李研，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究工作。