黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的保護(hù)作用

劉　舟，李月碧，張衛(wèi)華，劉華東，馬世平

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

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黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的保護(hù)作用

劉舟1，李月碧2，張衛(wèi)華1，劉華東1，馬世平2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

[摘要]目的觀察黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法取10只健康雄性SD大鼠作為空白組，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；另取健康雄性SD大鼠60只采用50 d高糖高脂飼料喂養(yǎng)合并一次性鏈脲佐霉素(STZ)35 mg/kg腹腔注射方法構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。將50只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組,二甲雙胍組及黃連溫膽湯低、中、高劑量組，每組10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/kg灌胃，黃連溫膽湯低、中、高劑量組分別給予黃連溫膽湯3，6，12 g/kg灌胃，模型組和空白組灌胃等體積生理鹽水，均連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃后測(cè)定大鼠飲食量、飲水量、尿量，取血檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，之后處死大鼠鏡下觀察肝臟組織表現(xiàn)，計(jì)算肝質(zhì)量指數(shù)。結(jié)果模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。模型組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。鏡下觀察各給藥組大鼠肝臟組織中細(xì)胞空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少。結(jié)論黃連溫膽湯能抑制糖尿病大鼠的肝腫大和炎癥反應(yīng)，降低血清AST和ALT水平及肝質(zhì)量指數(shù)，保護(hù)肝細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞]糖尿??； 肝損傷； 黃連溫膽湯

隨著人們生活水平的提升，糖尿病的發(fā)病率越來(lái)越高。糖尿病以代謝紊亂和高血糖為主要特征，可引起全身多臟器的病變。肝臟是糖代謝的主要器官，長(zhǎng)期的高血糖對(duì)肝臟的損害十分嚴(yán)重，但因其代償能力較強(qiáng)，早期的肝損傷并不明顯，但到后期肝損傷發(fā)展到一定程度后將無(wú)法逆轉(zhuǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病肝病的發(fā)生率為10%～30%[1]，且糖尿病患者死亡多因肝細(xì)胞損傷所引起[2]。肝臟是糖脂代謝的關(guān)鍵部位，糖尿病中出現(xiàn)的高血糖和脂質(zhì)堆積超出了肝臟的清除能力，造成肝臟損害，而肝臟損害之后糖脂代謝的調(diào)節(jié)能力進(jìn)一步下降，最終形成惡性循環(huán)，使得病變更加嚴(yán)重[3]。目前治療糖尿病的口服化學(xué)性降糖藥都有一定的不良反應(yīng)，且對(duì)肝臟有損傷作用，因此使得糖尿病肝損傷的治療難度加大。中醫(yī)認(rèn)為熱毒、瘀毒、痰毒、濕毒是糖尿病肝損傷的病因，因此可以通過(guò)清熱、活血、祛痰、化濕、解毒等方法治療糖尿病肝損傷[4]。黃連溫膽湯是中醫(yī)名方，首見(jiàn)于清朝陸廷珍的《六因條辨》，其主要功效是清熱燥濕、理氣化痰。臨床研究發(fā)現(xiàn)黃連溫膽湯對(duì)糖尿病[5]及其并發(fā)癥[6]、代謝綜合征[7]有很好的治療作用，但對(duì)糖尿病引起的肝損傷的影響尚少見(jiàn)報(bào)道，故本研究通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)觀察了黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病引起的肝損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥材與試劑黃連、竹茹、半夏、陳皮、枳實(shí)、茯苓、甘草、生姜均購(gòu)自先聲再康藥店。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，批號(hào)：20131102)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，批號(hào)：20141102)測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。鏈脲佐霉素(STZ)購(gòu)自Sigma公司，用檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)配制成10 mg/mL的溶液，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液(PBS)由8.0 g NaCl+0.20 g KCl+1.44 g Na2HPO4+0.24 g KH2PO4溶于800 mL雙蒸水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，加水至1 L。

1.2儀器酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，低溫離心機(jī)(Kubota，日本)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)，電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)等。

1.3動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠70只，購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0002，體質(zhì)量180～200 g。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律，室溫22～24 ℃，自由飲食飲水。

1.4方法

1.4.1藥材處理黃連溫膽湯中各藥物的比例按照清代陸皮∶茯苓∶甘草∶生姜=4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2)。將飲片浸泡30 min，水煎煮2次，每次煎30 min，用紗布趁熱濾過(guò)，60 ℃恒溫水浴濃縮至1.2 g/mL，冷藏備用。

1.4.2動(dòng)物分組與2型糖尿病模型的建立取10只健康雄性SD大鼠作為空白組，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；其余60只大鼠均用高糖高脂飼料(10%豬油、15%蔗糖、5%蛋黃粉、0.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、69%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)50 d后，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg。1周后測(cè)定大鼠血糖，血糖值>13.9 mmol/L證實(shí)造模成功。將50只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組及黃連溫膽湯低、中、高劑量組，每組10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/kg 灌胃，黃連溫膽湯低、中、高劑量組分別給予黃連溫膽湯3，6，12 g/kg(生藥材量)灌胃，模型組和空白組灌胃等體積生理鹽水。每日9：00—11：00灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d。

1.4.3食量、飲水量和尿量的測(cè)定末次灌胃后，將大鼠分別放入代謝籠中測(cè)定大鼠24 h內(nèi)食量、飲水量和尿量。

1.4.4血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的測(cè)定各組大鼠眼眶取血2 mL，靜置后3 500 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清AST、ALT水平。

1.4.5肝臟組織病理觀察每組取3只大鼠麻醉后，固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，從心尖插入針，剪開(kāi)右心耳，向心室內(nèi)灌注150 mL PBS和100 mL 4%多聚甲醛后取出肝臟，放入10%福爾馬林溶液中固定。使用冰凍切片機(jī)將肝臟切成4 μm的切片，用石蠟包埋好。根據(jù)說(shuō)明書(shū)脫水、透明再進(jìn)行肝臟HE染色，封片后在光學(xué)顯微鏡400倍視野下觀察組織病變情況。

1.4.6肝質(zhì)量指數(shù)每組剩余大鼠處死后完整取出大鼠肝臟稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肝質(zhì)量指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2結(jié)果

2.1各組大鼠基礎(chǔ)代謝情況比較模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠食量、飲水量和尿量比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組肝質(zhì)量指數(shù)和血清AST、ALT水平比較模型組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。各給藥組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間血清AST水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；黃連溫膽湯高劑量組ALT水平明顯低于黃連溫膽湯低劑量組(P<0.05)，而與二甲雙胍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組肝質(zhì)量指數(shù)和血清AST、ALT水平比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與黃連溫膽湯低劑量組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟病理表現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)空白組肝細(xì)胞排列整齊，核圓、大，居中，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組與空白組相比出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核被擠到一邊，細(xì)胞間空泡增多增大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多；而各給藥組細(xì)胞空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少。見(jiàn)圖1～6。

圖1　空白組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

圖2　模型組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

圖3　二甲雙胍組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

圖4　黃連溫膽湯低劑量組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

圖5　黃連溫膽湯中劑量組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

圖6　黃連溫膽湯高劑量組肝臟組織鏡下表現(xiàn)(HE，400×)

3討論

糖尿病是繼心血管疾病和腫瘤后的第三大威脅人類(lèi)健康的非傳染性疾病[8]，其中90%為2型糖尿病。2型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗造成的糖脂紊亂，而肝臟作為糖脂代謝的關(guān)鍵器官，受到的損傷最為嚴(yán)重，臨床主要表現(xiàn)為肝腫大、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化等。肝臟是糖原儲(chǔ)存的主要器官，機(jī)體各部分的能量供應(yīng)都是依賴(lài)于肝糖原分解成葡萄糖通過(guò)血液輸送至各組織細(xì)胞的。胰島素的分泌不足使得肝臟中的糖原難以被分解利用，因此長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)引起肝臟內(nèi)糖原過(guò)多蓄積，使得肝細(xì)胞腫脹，代謝紊亂,最終引起肝臟組織損傷[9]。另一方面，糖尿病患者對(duì)糖的利用障礙導(dǎo)致脂肪組織大量動(dòng)員，外周組織中脂肪分解增多，引起血液中游離脂肪酸增高，通過(guò)門(mén)靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，引起肝細(xì)胞中過(guò)度的脂質(zhì)堆積，也會(huì)損傷肝臟[10]。AST和ALT是臨床肝功能檢查的指標(biāo)，主要位于肝細(xì)胞內(nèi)，肝臟損傷后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ALT和AST滲漏進(jìn)入血液，結(jié)果使血清中 ALT 及 AST 含量升高。此外，肝細(xì)胞的破壞能引起炎性反應(yīng)，會(huì)使得組織外液內(nèi)流導(dǎo)致肝臟腫大。

黃連溫膽湯由二陳湯衍化而來(lái)，方中黃連清熱燥濕，竹茹清熱化痰，半夏、陳皮配伍燥濕化痰，茯苓健脾滲濕，枳實(shí)行氣破滯，生姜和胃，甘草調(diào)和諸藥，諸藥合用共奏清熱化痰行氣之功。本研究通過(guò)長(zhǎng)期高脂飼料喂養(yǎng)合并小劑量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組，各給藥組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能受到了其他因素的調(diào)控。模型組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組；各給藥組大鼠肝質(zhì)量指數(shù)及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組。鏡下觀察各給藥組大鼠肝臟組織中細(xì)胞空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少。表明黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病大鼠引起的肝損傷有較好的逆轉(zhuǎn)作用。

綜上所述，黃連溫膽湯能抑制糖尿病大鼠的肝腫大和炎癥反應(yīng)，降低血清AST和ALT水平及肝質(zhì)量指數(shù)，保護(hù)肝細(xì)胞。但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus

LIU Zhou1, LI Yuebi2, ZHANG Weihua1, LIU Huadong1, MA Shiping2

(1. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China; 2. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus. Methods 10 healthy male SD rats were selected as blank group and were fed with normal fodder, another 60 rats were given 50 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg/kg streptozocin (STZ) injection once to establish rat models of type 2 diabetic mellitus. 50 successful rat models were divided into model group treated with normal saline, metformin group treated with metformin (0.2 g/kg), and low, middle and high dose of Huanglian Wendan decoction groups treated with Huanglianwendan decoction (3, 6, 12 g/kg respectively), all the rats were treated by gavage for 30 days. After the end of gabage, the consumption of food, water and urinary volume were recorded and serum AST and ALT were determined, then the rats were killed to observe liver tissue changes under light microscope and calculate liver weight index. Results The consumption of food, water and urinary volume of the rats in model group were more than that in blank group (P all<0.05); the quality of water drink and urinary volume in every treatment group were less than that in model group (P all<0.05), there was no significant difference among every treatment group (P all>0.05). The difference in quality of food consumption was not significant between model group and other treatment groups (P all>0.05). Liver index and serum levels of AST and ALT in model group were higher than that in blank group (P all<0.05), but these indicators in every treatment group were lower than that in model group (P all<0.05). Light microscope showed than cell vacuolation and inflammatory cell invasion decreased obviously in every treatment group. Conclusion Huanglian Wendan decoction can inhibit hepatomegaly and inflammatory reaction in the rats with type 2 diabetic mellitus, decrease the levels of serum AST and ALT and liver weight index, protect liver cells.

Key words:diabetes; liver damage; Huanglian Wendan decoction

[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類(lèi)號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)02-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.002

[基金項(xiàng)目]教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20113237120007)；江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(12KJD360002)；江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LZ13001)；南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家基金預(yù)研項(xiàng)目(12XYY03)

[作者簡(jiǎn)介]劉舟，女，博士，講師，從事中醫(yī)藏象與病因病機(jī)的研究。[通信作者]張衛(wèi)華，E-mail：zwhtcm@163.com