苦丁茶冬青粗多糖的分離表征及其抗氧化活性研究

朱科學 朱紅英 賀書珍 張彥軍 譚樂和 馬帥

摘 要 水提醇沉法分離制備苦丁茶冬青粗多糖樣品，對其進行初步分離表征（包括總糖、糖醛酸、蛋白質、氨基酸含量和紅外光譜分析）和體外抗氧化活性（清除DPPH·自由基、·OH自由基清除能力和還原能力）研究。結果表明，苦丁茶冬青粗多糖中總糖含量為30.67%、糖醛酸含量為12.72%、蛋白質含量為9.35%；含有16種氨基酸成分，總含量為7.72%，其中含有7種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的40.41%；紅外光譜顯示該粗多糖樣品中含有α-吡喃糖環(huán)結構；此外，苦丁茶冬青粗多糖具有較強的體外抗氧化活性，且其抗氧化活性與多糖濃度之間存在良好的量效關系。

關鍵詞 苦丁茶冬青；多糖；結構；抗氧化作用

中圖分類號 TS272 文獻標識碼 A

Abstract Polysaccharides of Ilex kudingcha C.J. Tseng were obtained by hot water extraction and alcohol sedimentation. The physico-chemical （total sugar， uronic acid and protein） and antioxidant capacity（DPPH radical scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity and reducing power）of polysaccharides isolated from Ilex kudingcha C.J. Tseng. Polysaccharides were isolated sequentially using the Sevag method， ethanol grade precipitation and dried in a lab scale vacuum freeze dryer. The results indicated that the total sugar， uronic acid and protein contents of polysaccharides isolated from Ilex kudingcha C.J. Tseng were of 30.67%， 12.72% and 9.35%， respectively. The polysaccharides also contained 16 general amino acids （7.72%） with 7 essential amino acids. In IR spectra， characteristic absorptions range from 855 to 810 cm-1 were observed， indicating the α-configuration of the sugar units. The polysaccharides also exhibited strong scavenging activities on DPPH free radicals， hydroxyl radicals （·OH） and reducing-antioxidant power， and the antioxidant activity was significantly correlated with its concentration.

Key words Ilex kudingcha C.J. Tseng；Polysaccharides；Structure；Antioxidant capacity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.027

苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C.J. Tseng）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬常綠喬木。苦丁茶冬青含有豐富的氨基酸、維生素、黃酮、多酚、微量元素、多糖等多種營養(yǎng)物質，具有降血壓、降血脂、抗氧化、免疫調節(jié)和抗衰老等功效[1-2]。因此，人們常將苦丁茶作為保健茶、美容茶、減肥茶、降壓茶和益壽茶，有“綠色黃金”之美譽，是一種具有廣闊開發(fā)利用前景的自然資源。

以往對苦丁茶冬青活性成分的研究主要集中在多酚和黃酮類物質的分離、鑒定等方面，孫怡等[3]利用HPLC-DAD、質譜（MS）和核磁共振（NMR）技術分析發(fā)現(xiàn)：苦丁茶冬青的主要多酚類化合物為綠原酸及其衍生物。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶中咖啡?？鼘幩峋哂辛己皿w外抗氧化活性。陳志偉等[5]利用微波輔助提取苦丁茶總黃酮，并以總黃酮提取率為指標對提取條件進行優(yōu)化。

近年來，多糖（Polysaccharides）作為由醛基和酮基通過苷鍵連接的天然活性大分子物質，已引起越來越多的關注[6]。Fan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶冬青粗多糖具有良好的體外抗氧化活性和肝臟氧化損傷保護作用。何玲玲等[7]采用乙醇脫脂、水提取及80%乙醇沉淀的方法，從苦丁茶冬青葉中分離得到苦丁茶冬青葉粗多糖，通過比色法發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青多糖總糖含量為39.01%，蛋白質含量為5.16%，表明苦丁茶多糖是一種糖蛋白化合物。然而，有關苦丁茶多糖理化性質（包括總糖、糖醛酸、蛋白質、氨基酸種類及含量）、紅外光譜分析及其抗氧化特性缺乏系統(tǒng)研究。因此，筆者采用水提醇沉法制備苦丁茶冬青粗多糖，檢測其總糖、糖醛酸、蛋白質含量和氨基酸組分，利用紅外光譜進行分離表征和評價其體外抗氧化活性（DPPH·自由基、·OH自由基清除能力和還原能力），旨在為中國海南苦丁茶冬青資源的高效、綜合開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和試劑 苦丁茶冬青，由海南興科熱帶作物工程技術有限公司提供。

葡萄糖標品和DPPH購自美國Sigma公司；沒食子酸、KBr為光譜級試劑，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚購自上海荔達生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸為分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、無水乙醚均為分析純試劑，購自西隴化工股份有限公司；鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、抗壞血酸等均為國產分析純試劑。

1.1.2 儀器設備 ME4002E電子天平購自梅特勒-托利多（METTLER-TOLEDO）國際股份有限公司；旋轉蒸發(fā)儀RV10購自艾卡（廣州）儀器設備有限公司（IKA 中國）；SHB-IIIB循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿有限公司；LXJ-IIB多管離心機購自上海安亭科學儀器廠；JDG-0.2真空冷凍干燥機購自蘭州科近真空凍干技術有限公司；SPECORD 250 PLUS紫外可見分光光度計購自德國耶拿分析儀器股份公司（Analytik Jena AG）；Nicolet FT-IR 5700傅立葉紅外光譜儀購自美國賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 苦丁茶冬青粗多糖制備 苦丁茶冬青粗多糖的提取分離參照文獻[2， 7]方法，稍加改進：稱取苦丁茶冬青葉100 g，粉碎機粉碎，80%乙醇-水（V/V）4 ℃浸泡24 h，除去色素、單糖、寡糖等物質，過濾并進行真空冷凍干燥。按照1 ∶ 20加入蒸餾水后90 ℃提取2 h，3 000 r/min離心10 min，收集浸提液，旋轉蒸發(fā)進行濃縮。加入3倍體積無水乙醇4 ℃沉淀過夜，5 000 r/min離心10 min 收集苦丁茶冬青粗提物?？喽〔瓒啻痔嵛飺]干乙醇后蒸餾水復溶，以Sevag（氯仿 ∶ 正丁醇為4 ∶ 1，V/V）法進行脫蛋白處理，重復3次，然后用流動自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析液真空濃縮后按比例加入無水乙醇（濃縮液 ∶ 無水乙醇=1 ∶ 4），于4 ℃冰箱中醇沉過夜，5 000 r/min離心10 min，濾渣依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌2次，真空冷凍干燥制備苦丁茶冬青粗多糖。

1.2.2 苦丁茶冬青粗多糖中總糖含量分析 苦丁茶冬青粗多糖中總糖含量的測定參照文獻[8]方法并稍作改進：稱取干燥的苦丁茶冬青粗多糖樣品用超純水配成溶液（0.1 mg/mL），取2.0 mL苦丁茶冬青粗多糖溶液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液后搖勻，沿管壁緩慢加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置30 min后于490 nm波長處測定吸光度，以超純水作為空白對照。采用葡萄糖標品建立標準曲線，計算總糖含量。

1.2.3 苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸含量分析 采用硫酸-咔唑比色法[9-10]，以葡萄糖醛酸為標品測定苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸的含量。

1.2.4 苦丁茶冬青粗多糖中蛋白質含量分析 采用考馬斯亮藍G-250染色法對苦丁茶冬青粗多糖中蛋白質含量進行測定[11-12]，稱取牛血清蛋白標準品用超純水配制1 mg/mL母液，往母液中加入超純水配制一組濃度為0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL的牛血清蛋白標準溶液。

稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100 mL，最后用超純水定容到1 000 mL。

精確移取蛋白質標準溶液和苦丁茶冬青粗多糖溶液（0.1 mg/mL）各1.0 mL，向各管中加入5 mL的考馬斯亮藍G-250溶液，混合均勻，于室溫條件下反應10 min，以超純水為空白，于595 nm波長下測定其吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中的蛋白濃度。

1.2.5 氨基酸含量檢測 參照本團隊建立的分析方法[13]，采用德國Sykam（賽卡姆）S-433D型氨基酸分析儀進行測定。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取苦丁茶冬青粗多糖真空冷凍干燥粉末1～2 mg，與光譜級KBr混合研磨成細小顆粒，壓制成透明薄片，在波數(shù)為400～4 000 cm-1范圍內掃描其紅外光譜圖。

1.2.7 苦丁茶冬青粗多糖對DPPH·的抗氧化作用

稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液，取0.1 mL不同濃度的苦丁茶冬青粗多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL），加入3.0 mL DPPH溶液，混合均勻，暗室放置30 min，于517 nm處測定吸光度，以抗壞血酸（Vc）作為陽性對照。樣品對DPPH·自由基的清除率用公式（1）計算：

清除率/%=[（Ac-Ai）/Ac]×100 （1）

其中，Ai為樣品吸光度；Ac為空白對照吸光度（用蒸餾水代替樣品）

1.2.8 苦丁茶冬青粗多糖清除羥基自由基（·OH）能力的測定 參照文獻方法[14]，樣品組、空白組和對照組中依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（PBS， pH7.4，0.4 mol/L），1.0 mL鄰菲羅啉（2.5 mmol/L），試液1.0 mL，1.0 mL硫酸亞鐵（2.5 mmol/L），混勻后加入0.5 mL 0.01%H2O2；空白組用1.0 mL超純水代替樣品溶液；對照組用1.5 mL超純水代替樣品溶液和H2O2，37 ℃水浴反應60 min后測定536 nm處的吸光度值，以抗壞血酸（Vc）作為陽性對照。按照公式（2）計算羥基自由基（·OH）的清除率：

清除率/%=[1-（A2-A1）/（A0-A1）]×100 （2）

式中A0為對照組吸光度值，A1為空白組吸光度值，A2為樣品組吸光度值

1.2.9 苦丁茶冬青粗多糖還原力的測定 取0.4 mL不同濃度樣品溶液，加入0.8 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）以及0.8 mL 1% K3Fe（CN）6，搖勻，50 ℃反應20 min，而后加入0.8 mL 10% 三氯乙酸（W/V），混合后5 000 r/min離心10 min。取2.0 mL上清液，加入2.0 mL超純水和0.5 mL 0.1%（W/V） 三氯化鐵（FeCl3），室溫下反應10 min，吸光度于700 nm處測定，抗壞血酸用作陽性對照[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗實驗數(shù)據(jù)采用軟件SPSS Statistics 17.0進行分析，并采用Origin 7.5繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 苦丁茶冬青粗多糖總糖、糖醛酸、蛋白質含量分析

圖1-A顯示，苯酚-硫酸法作出葡萄糖標準曲線，得回歸方程y=0.012 9x+0.042 1，R2=0.996 3?？喽〔瓒啻侄嗵窃跐饬蛩嶙饔孟?，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚反應生成橙黃色液體，根據(jù)490 nm處吸光度平均值，計算得苦丁茶冬青粗多糖總糖含量為30.67%。

硫酸-咔唑比色法是根據(jù)糖醛酸與咔唑溶液發(fā)生縮合反應生成紫紅色化合物，其最大吸收波長為520 nm，以葡萄糖醛酸/半乳糖醛酸為標準品，計算多糖樣品中糖醛酸含量。圖1-B以不同濃度葡萄糖醛酸作標準曲線，得回歸方程y=0.005 4x+0.194 0，R2=0.976 7。通過回歸方程計算出苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸含量為12.72%。

考馬斯亮藍法測定苦丁茶冬青粗多糖中蛋白質的含量，以牛血清蛋白為標準，標準曲線如圖1-C所示，得回歸方程y=0.002 4x+0.043 9，R2=0.998 5。計算得苦丁茶冬青粗多糖中蛋白含量為9.35%。

2.2 苦丁茶冬青粗多糖氨基酸含量分析

圖2-A和圖2-B分別為18種標準氨基酸的分離色譜圖和苦丁茶冬青粗多糖中氨基酸的分離色譜圖。如表1所示，苦丁茶冬青粗多糖中含有16種氨基酸成分，總含量為7.72%，含量較高的有天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）。其中，苦丁茶冬青粗多糖中含有7種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的40.41%，分別為蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）。

2.3 紅外光譜分析

圖3為苦丁茶冬青粗多糖的紅外光譜圖，苦丁茶冬青多糖具有一般多糖在紅外光譜中的特征：紅外圖譜在3 372 cm-1處吸收峰為O-H的伸縮振動或N-H的伸縮振動，2 926 cm-1處為-CH2的C-H伸縮振動，這兩組吸收峰可以確定該類物質為多糖類化合物；1 639 cm-1處吸收峰為C=C鍵的伸縮振動，1 440 cm-1處是羧基（-C-O-O-H）的C-O伸縮振動引起的吸收峰，1 200～1 400 cm-1 處為C-H的彎曲振動，1 077 cm-1處吸收峰為C-O鍵（C-O-H， C-O-C）的伸縮振動，855-810 cm-1 處顯示吡喃糖α-端基差向異構的C-H變角振動。

2.4 DPPH·清除能力

如圖4所示，苦丁茶冬青粗多糖清除DPPH·自由基的能力隨著多糖濃度的增加而增強，當苦丁茶冬青粗多糖的濃度達到2 mg/mL時，清除能力趨于穩(wěn)定，達到72%。然而，同等濃度條件的抗壞血酸清除能力均為90%以上。

2.5 羥基自由基（·OH）清除結果

由圖5可知，苦丁茶冬青粗多糖對·OH清除能力較好，0.5 mg/mL濃度時，即顯示較強清除羥自由基的能力。其清除作用隨著多糖濃度的升高也逐漸加強，呈量效關系，但其清除能力比同濃度Vc的清除能力低。

2.6 還原能力分析

700 nm波長處測定吸光度高低可反映還原能力強弱，吸光度越高，還原力越強。圖6可以看出，苦丁茶冬青粗多糖的還原能力，在一定濃度范圍（0.25～1.0 mg/mL）隨著濃度的增加而增大，其效果與濃度呈正相關性；當濃度高于1.0 mg/mL時，其還原能力保持恒定。

3 討論與結論

多糖是苦丁茶冬青葉中一種極具開發(fā)價值的生物活性物質，F(xiàn)an等[2]對苦丁茶冬青水提物進行DEAE-52纖維素陰離子交換色譜層析，結果發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青粗多糖樣品中總糖含量為61.3%，糖醛酸含量為21.8%，蛋白質含量為5.8%。筆者采用苯酚-硫酸法測得苦丁茶冬青粗多糖中總糖含量為30.67%；通過考馬斯亮藍分析發(fā)現(xiàn)蛋白質含量為9.35%；硫酸-咔唑比色法測得苦丁茶冬青粗多糖的糖醛酸含量為12.72%。本實驗制備的苦丁茶冬青粗多糖需進一步純化。

氨基酸是構成蛋白質分子的基本單位，與生物的生命活動密切相關，是生物體內不可缺少的營養(yǎng)成分。苦丁茶冬青中含有多種氨基酸，梁遠發(fā)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶中氨基酸由16種水解氨基酸組成含有7種人體必需氨基酸和1種嬰兒必需氨基酸。本研究結果發(fā)現(xiàn)：苦丁茶冬青粗多糖中含有16種氨基酸成分，總含量為7.72%，含有7種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的40.41%，反映出苦丁茶冬青中游離氨基酸含量低，水解氨基酸含量較高。

抗氧化物質及其抗氧化活性在營養(yǎng)學、醫(yī)學領域越來越受到關注。大量研究表明，天然產物多糖是一種具有抗氧化活性的生物活性物質[17-18]。趙天湖等[19]發(fā)現(xiàn)，大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化多糖均對DPPH·、O2·- 和·OH有一定的清除作用，具有較強的還原能力與螯合金屬離子能力。吳曉鵬等[20]選用粗多糖A、DEAE-52纖維素柱分離物K1和葡聚糖凝膠G-100分離物K3 3種苦丁茶多糖進行抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，3種多糖對O2·- 、·OH和DPPH·自由基具有一定的清除作用；同時，對H2O2誘導紅細胞氧化溶血反應和紅細胞自氧化溶血反應都有顯著的抑制作用。本研究結果顯示，苦丁茶冬青粗多糖對DPPH·自由基和·OH自由基的清除能力隨著多糖濃度的升高也逐漸加強，呈現(xiàn)量效關系，與上述研究結果相一致。

苦丁茶冬青粗多糖可作為一種外源性抗氧化劑，在生物體內直接參與猝滅自由基，能增強機體防御毒性自由基損傷的能力，從而避免或減緩自由基對機體的損傷，在抗氧化和抗衰老方面具有廣闊的應用前景。但關于苦丁茶冬青多糖的結構與其抗氧化能力的關系有待于進一步的研究。

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