濟麥系列小麥熒光原位雜交（FISH）分析

宮文萍 李光蓉 韓冉 宋健民 李豪圣 劉愛峰 曹新有 楊足君 劉成 趙振東 劉建軍

摘要：以多聚核苷酸Oligo-pTa535-l和Oligo-pSc119.2-l為探針對濟麥系列小麥進行雙色熒光原位雜交（FISH）分析，結果發(fā)現(xiàn)，Oligo-pTa535-l的FISH信號主要分布在A和D染色體上，而Oligo-pSc119.2-l的FISH信號主要分布在B染色體上；濟麥系列小麥的FISH位點較小麥中國春差異位點主要集中在染色體4A、6B、7B和ID染色體上，且多為Oligo-pSc119.2-l信號；濟南17的IB染色體著絲粒區(qū)Oligo-pTa535-l信號、濟麥20的ID短臂末端和2A長臂末端的Oligo-pSc119.2-l信號、濟麥262的5A長臂中間的Oligo-pSc119.2-l信號可分別作為細胞學標簽用于其身份識別。濟麥系列小麥標準FISH核型的建立為利用染色體工程對其進行改良奠定了良好的細胞遺傳學基礎；FISH信號變異位點的類似性，說明濟麥系列小麥的遺傳基礎相對狹窄，應在今后育種工作中注意選擇與其親緣關系相對較遠的育種親本進行組配。

關鍵詞：濟麥系列小麥；多聚核苷酸；熒光原位雜交；染色體結構變異

中圖分類號：S512.1+10.351

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2016）01-0016-05

小麥是世界上重要的糧食作物之一。全世界有三分之一的人口以面食為主食，我國山東、河南、山西和陜西等多個省份也主要以面食為主食，因此，高產(chǎn)或超高產(chǎn)優(yōu)質小麥品種的培育對滿足人們飲食結構需求及應對糧食安全至關重要。本課題組先后育成的包括濟南17、濟麥19、濟麥20、濟麥21和濟麥22在內的大面積推廣濟麥系列小麥，是山東及全國小麥品種更新?lián)Q代的主導品種，為山東省糧食十連增、全國糧食九連增做出了重大貢獻。近年來又育成了濟麥23和濟麥0850262（以下簡稱濟麥262）等一批山東小麥的重要儲備品系。然而，濟麥系列小麥的抗病性仍有待改良，是育成超高產(chǎn)小麥的制約因素之一。

小麥遠緣物種是小麥育種的優(yōu)異基因源，可以用于濟麥系列小麥的遺傳改良。近期，本課題組從小麥一遠緣物種染色體系（附加系、代換系和易位系等）中篩選出了一批抗病性好且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質資源，可以直接或經(jīng)染色體工程改造后應用于濟麥系列小麥的改良工作。

熒光原位雜交（FISH）不僅可用于小麥染色體的識別，還可應用于小麥背景中遠緣物種染色體的鑒定，因而，可用于追蹤導人小麥的遠緣物種染色體（質）。唐宗祥等開發(fā)的以多聚核苷酸（Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1）為探針的雙色FISH可以有效區(qū)分小麥及其遠緣物種染色體。然而，不同麥區(qū)小麥品種（系）的FISH信號可能存在多樣性，對導人小麥背景中的遠緣物種染色體鑒定造成影響，因此，研究清楚相關小麥染色體的FISH模式對其遺傳改良至關重要。本研究對濟麥系列小麥進行了雙色FISH分析，獲得了濟麥系列小麥的標準FISH核型，為利用小麥遠緣物種改良濟麥系列小麥奠定了良好的細胞遺傳學基礎；此外，還發(fā)現(xiàn)了部分濟麥系列小麥的特異FISH位點，可作為細胞學標簽用于其身份識別。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為優(yōu)質小麥濟南17、面條小麥濟麥19、面條面包兼用小麥濟麥20、高產(chǎn)廣適小麥濟麥21、超高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)小麥濟麥22以及優(yōu)良品系濟麥23和濟麥262。前5個小麥品種及后2個小麥品系均由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥室育成。

試驗所用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1序列同文獻，由成都瑞信生物公司合成。

1.2 染色體制片和原位雜交

將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養(yǎng)皿中，放人220C的恒溫光照培養(yǎng)箱中。待種子萌動后，將培養(yǎng)皿轉到4cC冰箱中放置24h，之后，放人22℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待種子根尖長至1～2cm時，剪下根尖，用冰水處理22～24h。倒出冰水，用固定液（無水乙醇：冰醋酸=3：1，體積比）固定根尖7d以上，壓片備用。壓片方法參見文獻，原位雜交參見文獻。

2 結果與分析

2.1 濟南17的FISH分析

以Oligo-pTa535-l和Oligo-pSc119.2-1為探針對濟南17進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，濟南17的FISH信號與Tang等報道的中國春的信號類似，略有區(qū)別。濟南17在1B染色體著絲粒處有明顯的Oligo-pTa535-1信號，中國春在該處沒有該信號；濟南17的6B隨體末端、7B長臂末端均具有Oligo-pSc119.2-l信號，而中國春在該處沒有雜交信號；中國春2D長臂端部具有Oligo-pTa535-1信號，而濟南17的2D長臂端部未發(fā)現(xiàn)該信號（圖la）。

2.2 濟麥19的FISH分析

中國春在4A和6B長臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1雜交信號，而濟麥19這兩處未發(fā)現(xiàn)FISH信號（圖lb）；中國春在6A短臂末端具有Oligo-pTa535-1信號，而濟麥19在該處沒有信號；濟麥19的6B隨體末端、7B長臂末端和ID長臂近末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春的這三個位點沒有FISH信號。

2.3 濟麥20的FISH分析

濟麥20的2A染色體長臂中間、IB隨體末端、6B短臂末端和1D短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，并且前兩者信號相對較弱，后兩者信號較強（圖lc），而中國春在這四處沒有FISH信號。

2.4 濟麥21的FISH分析

中國春1A染色體著絲粒區(qū)、短臂近末端和末端均具有Oligo-pTa535-l信號，而濟麥21的1A染色體在短臂近末端具有Oligo-pTa535-1信號，短臂末端信號丟失且著絲粒區(qū)信號非常微弱（圖ld）。此外，濟麥21的1B和6B染色體隨體末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春在這兩處沒有FISH信號。在探針用量相同的情況下，濟麥21的1B隨體末端Oligo-pSc119.2-l信號較中國春和其他6份供試濟麥材料在該處的雜交信號強，說明探針序列在濟麥21的IB隨體末端可能發(fā)生過擴增。

2.5 濟麥22和濟麥23的FISH分析

濟麥23由濟麥22和豫麥34雜交并回交2次獲得，含有87.5%的濟麥22血緣，因而把這兩份材料并在一起分析。相比中國春的FISH信號，兩份材料FISH信號及信號變化位點具有一致性，即4A染色體長臂末端未發(fā)現(xiàn)Oligo-pSc119.2-1信號，而7B長臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號（圖le、g）。此外，對濟麥23的不同單株進行FISH分析時發(fā)現(xiàn)，存在染色體斷裂和重接現(xiàn)象，主要涉及染色體SB和6B（圖th、i），可能與所選樣品為育種早代材料有關。

2.6 濟麥262的FISH分析

中國春的SA長臂中間位置具有Oligo-pTa535-1信號，而濟麥262在該處的Oligo-pTa535-1信號非常微弱或丟失，但在該處具有較強的Oligo-pSc119.2-1 FISH信號（圖lf），說明Oligo-pTa535-1序列在該處發(fā)生刪除的同時還發(fā)生了Oligo-pSc119.2-l序列擴增。此外，濟麥262的6B染色體隨體末端和1D長臂末端都具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春在此處沒有該信號。中國春在6B長臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而濟麥262的6B長臂末端沒有該信號。

2.7 濟麥系列小麥FISH變異位點綜合分析

以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對7份濟麥系列小麥材料進行FISH分析，獲得其標準FISH核型（圖1），發(fā)現(xiàn)Oligo-pTa535-1探針主要雜交小麥A和D染色體，Ol-igo-pSc119.2-1探針主要雜交B染色體，與Tang等結果具有一致性，但在少數(shù)染色體上的信號又有所差異，差異位點主要集中在IA、2A、4A、6A、1B、6B、7B、1D和2D等染色體（表1），4A、6B、7B和1D染色體上的FISH信號變異頻率相對較高。相比中國春，濟麥系列小麥FISH位點變異有26處，其中，1處發(fā)生在染色體著絲粒區(qū)，11處（含隨體信號變異6處）發(fā)生在染色體短臂上，14處發(fā)生在染色體長臂上。

濟南17在1B染色體著絲粒處有明顯的Oli-go-pTa535-1信號（圖la），中國春和其他6份濟麥材料在此處均未發(fā)現(xiàn)該信號，因此，該信號可以作為濟南17的細胞學標簽，有效區(qū)分于中國春和其他供試濟麥材料。同理，濟麥20的1D短臂末端和2A長臂末端的Oligo-pSc119.2-1信號均可以作為濟麥20的細胞學標簽；濟麥262的SA長臂中間的Oligo-pSc119.2-1信號可以作為其細胞學標簽。

3 結論與討論

供試7份濟麥系列小麥中，濟麥19、濟麥22和濟麥23的4A染色體長臂末端沒有Oligo-pSc119.2-1信號，其長臂的Oligo-pTa535-1信號相比中國春的4A染色體的信號更靠近末端，說明4A染色體長臂末端可能發(fā)生斷裂。同時，這三份材料的7B染色體長臂末端都具有Oli-go-pSc119.2-1信號，而在中國春7B長臂末端沒有Oligo-pSc119.2-l信號，因此，我們推測4A染色體長臂片段可能易位到7B長臂末端。類似的染色體4/7同源群重組現(xiàn)象已經(jīng)在小麥、黑麥和山羊草等物種中發(fā)現(xiàn)，因而，這種非同源重組并不是獨立現(xiàn)象，可能在進化過程中這種染色體斷裂重接更有利于其適應環(huán)境。

唐宗祥等對黑麥/綿陽11雜交后代材料、黑麥/綿陽11/川農(nóng)27雜交后代進行了FISH分析，結果發(fā)現(xiàn)，小麥染色體發(fā)生了變異，變異主要集中在SA、6A、1B、2B、6B、7B、ID、3D和7D染色體上，認為這些染色體結構變異可能是由于黑麥染色體導入誘發(fā)的。葛群等研究發(fā)現(xiàn)黑麥染色體1R和SR單體附加系同樣可以誘導小麥染色體變異和異位。上述研究均是由于外源染色體導入導致了小麥染色體配對不正常而造成結構變異。本研究發(fā)現(xiàn)了濟麥23（濟麥22和豫麥34雜交后代）不同單株的細胞學不穩(wěn)定性，即在沒有外源染色體導人的情況下，小麥染色體自身結構發(fā)生斷裂，并形成染色體平衡易位。染色體平衡易位在人類染色體醫(yī)學中研究較多，但是在小麥中尚未被系統(tǒng)研究過，其易位機制也尚不清楚，值得今后進一步研究。

趙檀等研究河北省169份小麥品種的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，B染色體組具有最高的遺傳多樣性，4A、2D也有較高的多樣性水平。本研究發(fā)現(xiàn)小麥4A、6B、7B和2D染色體FISH變異位點較多，存在較高的多樣性，與上述研究結論具有一致性。蒲艷艷等利用SSR標記對山東省小麥品種遺傳多樣性進行了研究，認為山東省小麥品種遺傳多樣性較低。王江春綜合利用分子、生物化學和農(nóng)藝性狀調查等多種手段對建國以來山東省育成的小麥品種進行研究，發(fā)現(xiàn)山東省小麥品種的遺傳多樣性有逐漸下降的趨勢。本研究利用FISH對濟麥系列小麥進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH變異位點主要集中在少數(shù)幾條染色體上且具有類似性，說明濟麥系列小麥的遺傳基礎相對狹窄。通過對濟麥系列小麥的系譜進行追蹤，我們發(fā)現(xiàn)濟南17、濟麥19、濟麥20、濟麥22和濟麥23均含有魯麥13或魯麥14血緣，因此，濟麥系列小麥的類似FISH變異位點可能來源于魯麥13或魯麥14，需要進一步證實，相同血緣造成的遺傳基礎狹窄與本研究的FISH結果相互印證。因為濟麥系列小麥推廣面積大，且在常規(guī)育種中經(jīng)常被用作育種親本，因此，在今后的育種工作中應注意重點選擇與其親緣關系相對較遠的親本進行組配。