火龍果鐮刀菌果腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

朱迎迎　高兆銀　李敏　陳亮　胡美姣

摘 要 采用形態(tài)學(xué)特征觀察、rDNA-ITS序列、EF-1α序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析的方法對引起火龍果鐮刀菌果腐病病原菌進(jìn)行鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性。結(jié)果表明：引起火龍果鐮刀菌果腐病是單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum Penzig in Saccardo），這是該菌引起火龍果果腐病在國內(nèi)的首次報(bào)道。該菌菌絲生長的適宜溫度25～35 ℃，最適溫度30 ℃，適宜產(chǎn)孢溫度25～35 ℃，最適產(chǎn)孢溫度30～35 ℃，致死溫度75 ℃（10 min）；適宜pH5～9，最適pH7，最適產(chǎn)孢pH4；連續(xù)光照、D-果糖為碳源、牛肉膏和蛋白胨為氮源時(shí)最有利于該菌菌絲生長；完全黑暗、D-半乳糖為碳源、尿素為氮源時(shí)最有利于該菌產(chǎn)孢。綜合分析認(rèn)為，該菌耐高溫，光照充足、弱酸和富含有機(jī)營養(yǎng)的環(huán)境有利于該菌的生長和繁殖。

關(guān)鍵詞 火龍果；果腐?。粏胃翮牭毒?；鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S667.9；S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Morphological characteristics observation and rDNA-ITS sequencing and EF-1α sequencing were performed using dragon fruit Fusarium rot pathogens. Furthermore， the paper made a preliminary study of the biological characteristics of pathogen. The results showed that one of the pathogens was identified as Fusarium dimerum Penzig in Saccardo and it was the first report in China. For mycelial growth of F. dimerum， the suitable temperature ranged from 25 ℃ to 35 ℃ and the optimum temperature was 30 ℃. For sporulation， the suitable temperature ranged from 25 ℃ to 35 ℃ and the optimum temperature ranged from 30 ℃to 35 ℃. The fatal temperature for mycelial growth was 75 ℃ for 10 min. For mycelial growth， the suitable pH value ranged from 5 to 9， and the optimum pH value was 7. The optimum pH value for sporulation was 4. Continuous illumination， D-fructose and beef extract and peptone as carbon and nitrogen sources were conducive to mycelial growth； Darkness， galactose and carbamide as carbon and nitrogen sources were propitious to sporulation. It showed that F. dimerum had excellent heat resistance， and abundant sunlight， weakly acidic， rich in organic nutrition were conducive to the growth and reproduction of F. dimerum.

Key words Dragon fruit；Fruit Rot；Fusarium dimerum；Identification；Biological characteristic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.027

火龍果（Hylocereus spp.），又名紅龍果，為仙人掌科、量天尺屬植物，典型的熱帶水果[1]。近年來在我國海南、廣東、廣西、福建、云南、貴州、臺(tái)灣等地區(qū)均有栽培[2]?；瘕埞麑?shí)外形獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、綠色保健，含有豐富的植物性蛋白、甜菜色素、水溶性膳食纖維、各種酶、不飽和脂肪酸、抗氧化物質(zhì)及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[3-5]，對人體健康有特殊的功效，倍受消費(fèi)者青睞。但隨著我國火龍果種植面積的不斷擴(kuò)大，其采后病害有逐漸加重的趨勢[6]。據(jù)報(bào)道，能引起火龍果果腐病的真菌主要有鐮刀菌（Fusarium spp.）[7-9]、炭疽菌（Colletotrichum spp.）[10-11]、雙間柱頂孢（Scytalidium dimidiatum）[8，12]、 桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）[13-14]、仙人掌平臍蠕孢（Bipolaris cactivora）[15-16]等。筆者在對海南省火龍果采后病害初步分離中發(fā)現(xiàn)一株鐮刀菌，該菌具有較強(qiáng)的致病性，鑒于此，認(rèn)為對該病原菌進(jìn)一步研究是必要的。本研究采用形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS區(qū)序列、EF-1α序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析的方法進(jìn)行種類鑒定，并首次對該菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為火龍果鐮刀菌果腐病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病火龍果果實(shí)，從海南陵水火龍果基地采收的果實(shí)，貯藏發(fā)病的果實(shí)。

健康火龍果果實(shí)，購買于海南省海口市南北水果市場，新鮮、無損傷及無病害癥狀。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法。沿病果病健交界處取大小約3 mm×3 mm的小塊果皮組織，用0.1%的升汞酒精消毒約30 s，無菌水沖洗3次后，將組織塊置于PDA平板上，待菌落長出后挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，獲得純化菌株于試管中4 ℃保存，備用。

1.2.2 病原菌致病性測定 采用刺傷接種法。將菌餅（ф=5 mm）接種于健康火龍果果實(shí)上，每個(gè)果實(shí)接種2點(diǎn)，每處理接種3個(gè)果實(shí)，以接種無菌PDA塊為對照，置于保鮮盒中保濕。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株，轉(zhuǎn)接到新PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察，記錄菌落培養(yǎng)特征、菌絲體形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、厚垣孢子的有無和產(chǎn)生方式及分生孢子形態(tài)、顏色、大小等特征。參考文獻(xiàn)資料[17-18]對病原菌的形態(tài)進(jìn)行鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 （1）病原菌基因組DNA提取。將供試菌株接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d后，用接種針輕輕刮取約100 mg菌絲，用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA。

（2）rDNA-ITS和EF-1α序列擴(kuò)增。參照White等[19]設(shè)計(jì)真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAA

CCTGCGG-3′；ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3′。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：1.0 μL病原菌gDNA，2.0 μL 10 μmol/L ITS1，2.0 μL 10 μmol/L ITS4，25 μL 2×（HS）Taq-Mixture，20 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

參照Carbone[20]等利用EF-1α基因序列EF1-728F/EF1-986R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：EF1-728F：5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′；EF1-986R：5′-TACTTGAAGGAACCC TTACC-3′。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同上。

（3）病原菌rDNA-ITS和EF-1α序列克隆與測序。使用Invitrogen公司的TA Cloning試劑盒將目的片段連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將菌體懸浮液PCR檢測為陽性的克隆送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，將獲得的序列與NCBI中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對。

1.2.5 病原菌的生物學(xué)特性研究 （1）不同溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。挑取菌齡一致的病原菌菌塊（ф=5 mm）于PDA平板（d=90 mm）中央，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃的共9種溫度下培養(yǎng)，每處理3個(gè)皿，試驗(yàn)重復(fù)3次，6 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，10 d后，用5 mL無菌水洗下孢子，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定產(chǎn)孢量。

（2）不同pH值對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)滅菌后的PDA培養(yǎng)基，制成pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10和11的培養(yǎng)基，其余同1.2.5.1。

（3）光照對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。將菌餅（ф=5 mm）接種于PDA平板上，分別在完全黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照的條件下，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，其余方法同（1）。

（4）不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。以査氏固體培養(yǎng)基[21]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將蔗糖分別用等摩爾C量D-果糖、山梨醇、D-半乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、L-木糖代替，制成不同碳源培養(yǎng)基，以無碳源培養(yǎng)基作對照，其余方法同（1）。

（5）不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。以査氏固體培養(yǎng)基[20]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將硝酸鈉分別用等摩爾N量牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、硝酸銨、硝酸鈉、尿素代替，制成不同氮源培養(yǎng)基，以無氮源培養(yǎng)基作為對照，其余方法同（1）。

（6）致死溫度和時(shí)間測定。D-將菌餅（ф=5 mm）加入含5 mL無菌水的離心管中，分別置于50、55、60、65、70、75、80 ℃的恒溫水浴鍋中水浴10 min，待迅速冷卻后，將菌餅接種于PDA平板上，每天觀察菌絲生長情況。每處理3皿，重復(fù)4次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SAS 8.1軟件進(jìn)行分析和檢驗(yàn)，采用Duncan多重比較法進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

自然發(fā)病癥狀：該菌可為害火龍果果實(shí)，在果實(shí)、果蒂及其鱗片上形成圓形、暗黃色、水漬狀病斑，病斑部位有白色絨狀物，隨后病斑擴(kuò)大，與其他病斑愈合形成更大病斑（圖1）。

從自然發(fā)病的火龍果果實(shí)上共分離出7株真菌，將分離得到的病原菌依照柯赫氏法則回接鑒定證明，其中1株不具致病性，6株不同程度地導(dǎo)致火龍果采后腐爛，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，分別屬于鐮刀菌（Fusarium）、炭疽菌（Colletotrichum）和平臍蠕孢（Bipolaris）等3個(gè)屬的真菌。其中鐮刀菌致病性較強(qiáng)，接種于果實(shí)上，3 d后病斑直徑達(dá)到36.8 mm。該菌可導(dǎo)致火龍果果實(shí)表面形成圓形、暗黃色、水漬狀病斑、病斑凹陷且邊緣清晰，隨后病部褐變軟腐，與自然發(fā)病火龍果的癥狀相符合（圖1）。

該菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，菌落達(dá)到55 mm，圓形，氣生菌絲體初為白色后橘黃色，絨狀，PDA基物背面為米黃色。大型分生孢子短，中等偏窄，兩端稍尖，頂細(xì)胞彎曲，多數(shù)單個(gè)隔膜，小孢子橢圓形、新月形，無色透明，有的孢子中央有油滴，分生孢子大小7.0～22.0 μm×2.5～3.5 μm，產(chǎn)孢方式為單瓶梗式；厚垣孢子球形，在菌絲間串生，表面光滑，直徑8～12 μm（圖2）。

2.2 病原菌分子鑒定

2.2.1 病原菌rDNA-ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 經(jīng)測序，菌株HL-J2的rDNA-ITS序列為564 bp（登錄號(hào)：KR139925）。將該序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該病原菌的rDNA-ITS序列與單隔鐮刀菌（登錄號(hào)：JQ434586、EU92620）的同源性均達(dá)到99%，用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），另外選取13株同源性高低不同的菌株進(jìn)行多重序列比較，并做系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。結(jié)果表明：病原菌與單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum）遺傳距離最小，聚為一類，支持率為99%。

2.2.2 病原菌EF-1α序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 經(jīng)測序，菌株HL-J2的EF-1α序列為291 bp（登錄號(hào)：KT439328）。將該序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該病原菌的EF-1α序列與單隔鐮刀菌（登錄號(hào)：KJ534575、KC572088、EU926347）的同源性均達(dá)到96%，用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），另外選取13株同源性高低不同的菌株進(jìn)行多重序列比較，并做系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。結(jié)果表明：病原菌與單隔鐮刀菌（F. dimerum）遺傳距離最小，聚為一類，支持率為96%。

結(jié)合菌株HL-J2的形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS序列、EF-1α序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該病原菌為單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum Penzig in Saccardo）。

2.3 病原菌生物學(xué)特性分析

2.3.1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 該菌在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長，生長適宜溫度25～35 ℃，最適溫度30 ℃時(shí)，菌落直徑極顯著大于其他處理的菌落直徑，10、15 ℃生長緩慢，5、40 ℃停止生長，將5、40 ℃的菌塊恢復(fù)到常溫時(shí)，5 ℃條件下的菌絲呈現(xiàn)緩慢生長現(xiàn)象，而40 ℃條件下的菌絲停止生長。說明，低溫對菌絲無致死作用，只能抑制菌絲生長，恢復(fù)常溫后仍具生長能力，而高溫則可使菌絲喪失生活力（圖5）。此外，35 ℃條件下培養(yǎng)的菌落出現(xiàn)明顯的輪紋。該菌在15～35 ℃范圍均能產(chǎn)孢，在30～35 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最大，極顯著高于其他溫度的產(chǎn)孢量，溫度低于10 ℃或者達(dá)到40 ℃都不能產(chǎn)孢。故該菌最適宜產(chǎn)孢溫度為30～35 ℃（圖5）。

2.3.2 pH值對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 該菌在pH3～11時(shí)菌絲均能生長，pH3時(shí)，菌絲生長緩慢，pH4～8時(shí)，菌絲生長速率增快，在pH7時(shí)，菌落直徑極顯著高于其他pH值的菌落直徑，隨后菌落直徑逐漸減小。由此表明，該菌適宜生長pH為5～9，最適pH為7（圖6）。pH為3時(shí)，該菌不產(chǎn)孢，pH4時(shí)，產(chǎn)孢量最大，為1.71×106個(gè)/mL，極顯著高于其他pH值的產(chǎn)孢量，pH在5～11范圍內(nèi)產(chǎn)孢量下降。故該菌產(chǎn)孢最適pH為4（圖6）。

2.3.3 光照對菌絲生長及產(chǎn)孢量影響 菌株HL-J2在連續(xù)光照、12 h光暗交替、完全黑暗3種光照條件下均能生長，其中連續(xù)光照的菌落直徑極顯著高于12 h光暗交替和完全黑暗的菌落直徑（圖7）。完全黑暗有利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為0.95×106個(gè)/mL，極顯著高于其他兩個(gè)處理的產(chǎn)孢量（圖7）。

2.3.4 不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)孢量影響 菌株HL-J2在供試的9種碳源培養(yǎng)基上均能生長，其中，以D-果糖的利用率最高，培養(yǎng)6 d后菌落直徑為47.21 mm，極顯著高于其他碳源的菌落直徑。以葡萄糖和果糖為碳源時(shí)，該菌生長緩慢，菌落直徑極顯著小于無碳源的菌落直徑，但菌絲生長旺盛，而無碳源的培養(yǎng)基菌絲雖然生長快，但菌絲稀疏，難觀察（圖8）。D-半乳糖有利于該菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量最大，為26.43×106個(gè)/mL，極顯著高于其他碳源的產(chǎn)孢量，而葡萄糖不利于該菌產(chǎn)孢（圖8）。

2.3.5 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量影響 菌株HL-J2在供試的9種氮源培養(yǎng)基上均能生長，以牛肉膏和蛋白胨利用率最高，培養(yǎng)6 d的菌落直徑分別為44.2和44.1 mm，極顯著高于其他氮源的菌落直徑。以硝酸銨為氮源時(shí)，菌絲生長最慢，菌落直徑顯著小于無氮源的菌落直徑，但菌絲生長旺盛，而無氮源雖然生長較快，但菌絲稀薄（圖9）。尿素有利于該菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量最大為24.02×106個(gè)/mL，極顯著高于其他氮源的產(chǎn)孢量，其次是L-精氨酸和硝酸鈉，在蛋白胨、牛肉膏和無氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量極顯著低于其他氮源的產(chǎn)孢量（圖9）。

2.3.6 致死溫度測定 經(jīng)50～70 ℃處理10 min后，發(fā)現(xiàn)菌株HL-J2在PDA上均能生長。但75 ℃及以上溫度處理，菌絲不再生長，則表明該菌菌絲的致死溫度是75 ℃，10 min。

3 討論與結(jié)論

單隔鐮刀菌又稱雙胞鐮孢（Fusarium dimerum），屬半知菌亞門、從梗孢目、瘤座孢科、鐮刀菌屬真菌。Penzig[22]首次對該菌進(jìn)行描述，認(rèn)為其分生孢子只具有單隔膜，但Wollenweber & Reinking[23]和 Schroers H J[24]進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，該菌分生孢子除具有單隔外，還有0～3隔。本研究在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該菌大型分生孢子多為單隔，小型孢子無隔。因此，通過對該菌大、小型分生孢子的產(chǎn)生情況及其形態(tài)大小，厚垣孢子的有無和產(chǎn)生方式等，同時(shí)結(jié)合rDNA-ITS序列、EF-1α序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，認(rèn)為引起火龍果鐮刀菌果腐的病原菌之一為F. dimerum。

Domsch等[25]認(rèn)為該菌廣泛分布在土壤和植物，寄主范圍廣。目前已報(bào)道，該菌可引起香蕉軸腐病[26]，甘草[27]、豌豆[28]、蠶豆[29]根腐病，馬鈴薯葉斑病[30]等。此外，研究還發(fā)現(xiàn)該菌也可危害人體，引起人類角膜潰瘍病[31]，同時(shí)也可以降低人體免疫力[32]等。馬騰飛等[33]認(rèn)為鐮刀菌（Fusarium spp.）是上海市售進(jìn)口火龍果主要病害之一，但尚未確定到種。崔志婧等[9]認(rèn)為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和單隔鐮刀菌（F. dimerum）是上海進(jìn)口火龍果致病真菌，其中，F(xiàn). oxysporum為進(jìn)口火龍果最主要病原真菌。盧琨等[7]研究認(rèn)為磚紅鐮刀菌（F. lateritium Nees）可引起火龍果采后貯藏病害。筆者等對海南生產(chǎn)的火龍果采后病害研究發(fā)現(xiàn)單隔鐮刀菌對火龍果致病性較強(qiáng)，可引起火龍果果實(shí)大量腐爛，這與崔志婧[9]等對上海進(jìn)口火龍果軟腐病病害分析的結(jié)果一致，且該菌引起國內(nèi)火龍果果腐病為首次報(bào)道。

雖然該菌在香蕉、甘草、蠶豆、豌豆等作物上有報(bào)道，但均未對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。鑒于此，開展單隔鐮刀菌（F. dimerum）生物學(xué)特性研究對指導(dǎo)該病的防治更加必要和有意義。研究發(fā)現(xiàn)該菌菌絲生長的適宜溫度25～35 ℃，最適溫度30 ℃，最適產(chǎn)孢30～35 ℃；適宜pH值5～9，最適宜pH值7，最適產(chǎn)孢pH4。連續(xù)光照有利該菌生長，完全黑暗雖然不利于該菌生長但有利于該菌產(chǎn)孢；此外，該菌以D-果糖為碳源和以蛋白胨、牛肉膏為氮源時(shí)，菌絲生長最快，以D-半乳糖為碳源和尿素為氮源時(shí)，有利于該菌產(chǎn)孢。該菌致死溫度達(dá)75 ℃，10 min。綜合分析認(rèn)為該菌耐高溫，光照充足、弱酸和富含有機(jī)營養(yǎng)的環(huán)境有利于該菌的生長和繁殖。因此，在對該病害防治中要盡量避免其生長和產(chǎn)孢有利條件。本研究結(jié)果為今后火龍果鐮刀菌果腐病綜合防治以及其致病原理提供參考價(jià)值。

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