右美托咪定對乳大鼠心肌細胞線粒體活性氧和細胞凋亡的影響*

曹露 周丹 李濤 陳琳琳 譚曉秋 劉力 劉雪茹△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科； 2.醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室·西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，四川 瀘州 646000)

論 著

右美托咪定對乳大鼠心肌細胞線粒體活性氧和細胞凋亡的影響*

曹露1周丹1李濤2陳琳琳2譚曉秋2劉力1劉雪茹1△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科； 2.醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室·西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，四川 瀘州 646000)

目的：探討右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)對線粒體介導的乳大鼠心肌細胞氧化應激通路的作用。方法：取新生乳大鼠(3～4天)的心肌進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后分為對照組(C組)、H2O2組(終濃度500 μM，H組)、右美托咪定組(5 μM DEX，D組)、聯(lián)合用藥組(500 μM H2O2+5 μM DEX，DH組)。各組細胞分別給予相應藥物刺激6 h，采用流式細胞儀測定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平及心肌細胞凋亡變化；并通過ELISA法測定各組乳大鼠心肌細胞線粒體介導的凋亡因子Caspase-3，Caspase-9表達的變化。結(jié)果：與H2O2組相比，DEX明顯抑制H2O2介導的乳大鼠心肌細胞的ROS水平增加(P<0.05)；下調(diào)線粒體介導的下游凋亡因子Caspase-3, Caspase-9的表達(P<0.05)，從而減少H2O2誘導的凋亡(P<0.05)。結(jié)論：右美托咪定通過抑制心肌細胞活性氧水平以及下調(diào)線粒體介導的Caspase-3和Caspase-9的表達發(fā)揮抑制凋亡作用，對心肌細胞有一定的保護作用。

右美托咪定；心肌細胞；活性氧；氧化應激；細胞凋亡

右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一種新型的高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，目前廣泛應用于ICU和手術(shù)過程中[1,2]?？赏ㄟ^抑制交感神經(jīng)興奮性和增強迷走神經(jīng)興奮性，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗驚厥、抗寒顫、催眠遺忘、穩(wěn)定血流動力學、減少插管時應激反應、減少麻醉劑與阿片類藥物的用量和改善麻醉恢復等一系列作用[3]。右美托咪定對機體許多重要臟器如心臟、大腦、腎臟、肝、肺、胃腸道等具有保護作用[4,5]。有研究報道提示，DEX減少心肌I/R損傷可能與調(diào)控心肌線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transition pore, mPTP)開放及其上游線粒體ATP敏感性鉀通道(Mitochondrial ATP sensitive potassium channels, mitoKATP)活性有關(guān)[6]。由于線粒體氧化應激在心肌損傷與保護中發(fā)揮重要作用，而活性氧(Rreactive oxygen species，ROS)在一定程度上能夠反應細胞氧化應激程度。本文擬探討右美托咪定對線粒體介導的乳大鼠心肌細胞氧化應激通路的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

新生SD大鼠3～4天(由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供)；右美托咪定(江蘇恩華)；H2O2(Sigma，美國)；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco，美國)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美國)；羅丹明標記鬼筆環(huán)肽(Rhodamine Phalloidin)(Cytoskeleton，美國)；DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)、活性氧檢測試劑盒、Caspase-3和Caspase-9試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

首先將新生乳鼠心臟在無菌條件下取出，經(jīng)PBS液反復沖洗后，剪去心房和結(jié)締組織，然后再用PBS液沖洗，剪成1 mm3碎塊，再加入0.25%胰蛋白酶置于4℃冰箱過夜，Ⅱ型膠原酶洗滌2次，直到心臟組織基本消化完畢，1500 g·min-1離心5min后去除上清液，再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將沉淀充分吹打混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中通過差速貼壁，以去除心臟的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞，再次的心肌細胞懸液取8 ml接種到4個3.5 cm的培養(yǎng)皿中并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后分組處理。

1.3 實驗分組

實驗分為四組：對照組(C組)、H2O2組(H組)、右美托咪定組(D組)、右美托咪定+H2O2組(DH組)。首先對D組和DH組加入終濃度為0.5 μM的右美托咪定，隨后置于37℃細胞培養(yǎng)箱12 h孵育。待孵育結(jié)束后，在H組和DH組中加入500 μM的H2O2進行孵育。

1.4 流式細胞術(shù)檢測活性氧自由基(ROS)水平變化

由于乳鼠心肌細胞是貼壁細胞，采用原位裝載探針檢測ROS的方法。使用1:1000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μM。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。各組心肌細胞于37℃下避光孵育0.5 h，再用PBS洗兩次，然后用流式細胞儀檢測。同時設置陽性對照(Rosup)，通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0～30 min后可以顯著提高活性氧水平。

1.5 ELISA法檢測Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達

Caspase-3，Caspase-9檢測方法按照試劑盒(江蘇碧云天公司)說明書進行，主要包括測定pNA標準曲線、樣品收集、酶活性的檢測等實驗步驟。以對照組(未經(jīng)DEX和H2O2處理)的pNA的量為1，對其他三組的pNA的量進行標準化，從而比較各組Caspase-3，Caspase-9的活性。

1.6 細胞免疫熒光實驗

采用FITC標記α-肌動蛋白觀察培養(yǎng)的心肌細胞的形態(tài)。將培養(yǎng)的心肌細胞鋪在玻片上生長，48 h后取出，PBS清洗三遍后分別用4%的多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%的Triton X-100處理20 min，5%的BSA室溫封閉1 h，之后使用小鼠抗α-肌動蛋白一抗4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠二抗孵育1 h，最后使用DAPI室溫孵育10 min后進行封片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

采用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡。培養(yǎng)的心肌細胞經(jīng)過上述處理之后，使用胰酶消化為單個的心肌細胞，按照試劑盒說明書進行染色后使用流式細胞儀(BD公司)進行檢測細胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞形態(tài)學

使用FITC標記α-肌動蛋白觀察心肌細胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。培養(yǎng)的心肌細胞呈梭形，橫紋和肌動蛋白清晰。

圖1 乳鼠心肌細胞形態(tài)(600X)藍色：DAPI染的細胞核；綠色：FITC標記的α-actin。

2.2 DEX對H2O2誘導的心肌細胞ROS的影響

與對照組相比，陽性處理組(Rosup)的ROS水平明顯增加(P<0.01)。500 μM H2O2處理6 h后，ROS水平也明顯增加(P<0.05)。聯(lián)合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，與單純使用H2O2組相比，ROS水平明顯下降(P<0.05)。而單獨使用5 μM DEX，ROS水平的下降并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 DEX對H2O2誘導的心肌細胞ROS的影響(n=5)注：與Control相比，*P<0.05；與500 μM H2O2組相比，#P<0.05。

2.3 DEX對H2O2誘導的心肌細胞Caspase-3、Caspase-9表達的影響

與對照組相比，500 μM H2O2處理6 h后，Caspase-3和Caspase-9表達明顯增加(P<0.01)。聯(lián)合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，與單純使用H2O2組相比，Caspase-3和Caspase-9表達明顯增加(P<0.05)。與對照組相比，聯(lián)合使用的H2O2和DEX的Caspase-3和Caspase-9表達依然有所增加(P<0.05)。而單獨使用5 μM DEX，Caspase-3和Caspase-9表達水平有所降低，但并沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 DEX對H2O2誘導的心肌細胞Caspase-3、-9活性的影響(n=4)注：與Control相比，*P<0.05，**P<0.05；與500 μM H2O2組相比，#P<0.05。

2.4 DEX對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的影響

從圖4中可以看出，對照組細胞僅有19.9%的細胞凋亡率(第一象限和第四象限之和)，而使用H2O2處理之后，細胞凋亡率明顯增加，由19.9%增加到65.7%(其中早期凋亡占46.2%，晚期凋亡占19.5%)。在使用H2O2的同時加入右美托咪定，可以明顯降低細胞凋亡率，細胞凋亡率為38.0%(其中早期凋亡占24.9%，晚期凋亡占13.1%)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測DEX對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的影響注：Negative為沒有使用凋亡檢測試劑的陰性對照，用于細胞形態(tài)和熒光校正與調(diào)零。

3 討論

右美托咪定(DEX)因具有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛，抗交感而無呼吸抑制的臨床特點而在臨床上廣泛使用。有研究表明DEX還具有心肌保護作用，包括能夠降低心輸出量、前后負荷，減慢心率，降低心肌耗氧量，增加心內(nèi)膜的血液供應，使心肌氧供需趨于平衡[7]。但是也有研究提示右美托咪定不但對血流動力學和冠狀動脈血流量沒有影響，反而增加心肌梗塞面積[8]。表明右美托咪定對心肌保護的作用機制還需進一步研究。

線粒體是真核動物細胞進行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，被稱為細胞的“動力工廠”。線粒體生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的過程中伴隨著活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[9]。ROS是參與維持細胞正常生理功能[10]，以及組織修復等活動，而當ROS將過度生成，超過了抗氧化的能力，增加了心肌氧化的應激反應,進而對線粒體的功能和能量的產(chǎn)生造成了不可逆的損傷，最終導致心肌細胞凋亡[11]。因此可知線粒體氧化應激將導致線粒體能量代謝失調(diào)，從而進一步損傷了線粒體[12]。心肌細胞的凋亡是心肌損傷的重要機制，而線粒體凋亡途徑在心肌細胞的凋亡起著非常重要的作用[13]。Caspase-3、Caspase-9活性和表達增加被認為是線粒體凋亡途徑發(fā)生的標志[14]。有關(guān)通路在DEX心肌細胞保護中的作用的研究未見系統(tǒng)的報道。

過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激模型是常用于研究心肌細胞氧化應激損傷的手段之一，本實驗研究了DEX對H2O2誘導的氧化應激損傷后ROS和細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果表明，H2O2明顯增加心肌細胞ROS水平，使線粒體介導的細胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-9表達增加，導致心肌細胞凋亡。而DEX能夠一定程度逆轉(zhuǎn)了H2O2導致的氧化應激損傷。結(jié)果表明DEX能夠作用于心肌細胞的線粒體凋亡通路，抑制H2O2對心肌細胞的損傷，降低了心肌細胞凋亡。實驗結(jié)果表明,單給DEX組的ROS產(chǎn)生與正常組相比不存在差異，這說DEX并未對基礎水平的ROS產(chǎn)生影響。而H2O2則會引起心肌細胞ROS產(chǎn)量增加，造成過量的ROS得不到有效的清除。因此過量的ROS能夠造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，引起線粒體凋亡通路活化，并導致細胞凋亡。而DEX能夠緩解治療組心肌細胞的氧化應激負荷，抑制細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，減少Caspase-3、Caspase-9的表達活性。

綜上所述，DEX能夠抑制心肌細胞的線粒體凋亡途徑，達到保護心肌細胞的作用，但是其具體的信號轉(zhuǎn)導機制還需進一步的深入研究。

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Effects of dexmedetomidine on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells*

Cao Lu1, Zhou Dan1, Li Tao2, Chen Lin-lin1, Tan Xiao-qiu1, Liu Li1, Liu Xue-ru1△

(1.Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University; 2. Key Lab of Medical Electrophysiology, Ministry of Education; Institute of Cardiovascular Medicine, Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate the effects of dexmedetomidine (DEX) on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells. Methods: Neonatal rats (3-4 days) cardiomyocytes (NRCMs) were cultured for 24 h and divided into four groups: control group (Group C), H2O2group (final concentration of 500 μM, Group H), dexmedetomidine group (5 μM DEX, group D), and H2O2+DEX group (500 μM H2O2+ 5 μM DEX, group DH). Flow cytometry (FCM) was used to measure the effect of DEX on the ROS level and apoptosis of myocardial cells in rats. The level of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by ELISA. Results: DEX significantly inhibited the increase of ROS levels in NRCMs induced by H2O2(P<0.05). The increased level of Caspase-3, Caspase-9 induced by H2O2was significantly inhibited by DEX (P<0.01 or P<0.05). DEX significantly attenuated cells ratio of apoptosis induced by H2O2(P<0.05). Conclusion: Dexmedetomidine inhibited the ROS levels and the activity of mitochondria mediated Caspase-3 and Caspase-9 expression and attenuated H2O2-induced apoptosis in myocardial cells, which may involved in the myocardial protective effect of DEX.

Dexmedetomidine; Myocardial cells; ROS; Oxidative stress; Apoptosis

國家自然科學基金資助項目(編號：81401632)；西南醫(yī)科大學青年基金項目(編號：2014QN-003)

曹露，女，碩士研究生在讀，主要從事臨床麻醉學研究，Email：85933718@qq.com。

△通訊作者：劉雪茹，女，講師，主要從事臨床麻醉學研究，Email：liuxueru1981@163.com。

2016-11-28)