BraSDG2 RNA干擾載體的構(gòu)建和擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

周雅智 姜玲 黃勇

摘要：多倍化是植物進(jìn)化過(guò)程中的自然現(xiàn)象，也是植物進(jìn)化的重要源泉。在前期的研究中，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二倍體的白菜型油菜中存在兩個(gè)擬南芥SDG2的同源基因BraSDG2a（Bra037086）和BraSDG2b（Bra039562）。經(jīng)序列比對(duì)，選取258 bp的保守序列構(gòu)建RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi。通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（Col-0），經(jīng)抗性篩選及PCR檢測(cè)，獲得1株表型穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥（純合體）的表型觀察發(fā)現(xiàn)，BraSDG2 RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株具有擬南芥sdg2突變體相似的生物學(xué)表型，植株弱小、種子稀少。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究BraSDG2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白菜型油菜；BraSDG2；RNA干擾；擬南芥；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S634.301文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）10-0007-05

據(jù)估計(jì)，50%～70%的被子植物在其進(jìn)化過(guò)程中至少經(jīng)歷過(guò)1次多倍化過(guò)程[1]，基因表達(dá)的變化在多倍體化過(guò)程中起著重要作用[2]。組蛋白甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在參與重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)方面起到重要作用，其主要包括賴氨酸和精氨酸的甲基化[3]。組蛋白賴氨酸（K）甲基化修飾包括組蛋白H3的K4、K9、K27、K36和組蛋白H4的K20的單、雙和三甲基化的修飾狀態(tài)。組蛋白H3K4及H3K36的甲基化修飾被認(rèn)為參與基因表達(dá)的激活，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化修飾則被認(rèn)為與基因沉默及異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的維持相關(guān)[4]。

擬南芥SDG2編碼一個(gè)包含2 335個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其含有SET、Post-SET、GYF保守結(jié)構(gòu)域，具有特異的H3K4me3甲基轉(zhuǎn)移酶活性。SDG2突變后，擬南芥的育性完全喪失，50%的四分體包含小孢子的數(shù)量少于四個(gè)，且BT3、SPL、MS1、EDA31、MEE65等11個(gè)與雄配子發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)[5]。因此，SDG2介導(dǎo)的H3K4me3甲基轉(zhuǎn)移酶活性影響著雄配子體的發(fā)育及植物育性。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）所介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及翻譯水平上干擾基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)是一種研究功能未知基因的有效方法。我們前期的研究表明，在二倍體的白菜型油菜中，BraSDG2具有2個(gè)拷貝，并具有不同的組織表達(dá)模式，這些結(jié)果暗示在基因多倍體化過(guò)程中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因的命運(yùn)可能發(fā)生了明顯分化[6]。本研究擬通過(guò)構(gòu)建BraSDG2的RNA干擾載體，經(jīng)浸花法轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥（Col-0），篩選BraSDG2基因沉默的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株并觀察其表型特征，為進(jìn)一步研究白菜型油菜BraSDG2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

白菜型油菜（Brassica rapa）B2；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α；根癌農(nóng)桿菌GV3101；載體pMD19-T vector和pFGC5941（含PPT抗性）。以上試驗(yàn)材料均來(lái)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1白菜型油菜BraSDG2-RNAi片段的克隆從Tair與白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)BRAD收集擬南芥SDG2、白菜BraSDG2a和BraSDG2b CDS序列，經(jīng)比對(duì)分析后選取一段258 bp的保守序列，命名為BraSDG2-RNAi。設(shè)計(jì)引物序列BraSDG2-RNAi F：5′-CCATGGTCTAGATTGGTGGGCTGCCAGATTG-3′（下劃線分別表示NcoⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)）；BraSDG2-RNAi R：5′ -GGCGCGCCGGATCCGATCCCCAAACACACGTCTCATAAC-3′（下劃線分別表示Asc Ⅰ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。

高保真酶PCR擴(kuò)增后獲得RNA干擾目的片段，切膠回收后連接到pMD19-T載體上，命名為pMD19-T-BraSDG2-RNAi，將連接好的載體通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的單菌落提取質(zhì)粒測(cè)序。

1.2.2RNAi載體的構(gòu)建使用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和pFGC5941。將反向BraSDG2-RNAi片段導(dǎo)入終止子與CHSA intron之間，獲得中間載體p-BraSDG2-RNAi；再通過(guò)AscⅠ和NcoⅠ對(duì)載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和p-BraSDG2-RNAi進(jìn)行雙酶切，將正向BraSDG2-RNAi片段導(dǎo)入35S啟動(dòng)子與CHSA intron之間，最終獲得RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi。對(duì)獲得的RNA干擾載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選將pFGC5941-BraSDG2-RNAi導(dǎo)入到工程菌GV3101后，挑選陽(yáng)性菌落用于擬南芥轉(zhuǎn)化。通過(guò)浸花法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥（Col-0）中，采用濃度為100 mg/mL的PPT篩選T0代擬南芥轉(zhuǎn)化子。設(shè)計(jì)檢測(cè)引物35S825 F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3′，Intron825 R：5′-TGAC-TCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3′，對(duì)獲得的抗性苗進(jìn)行PCR檢測(cè)篩選轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.4轉(zhuǎn)化子的表型觀察將野生型、T3代和T4代（純合體）轉(zhuǎn)基因擬南芥種子經(jīng)4℃春化2～3 d后，置于22℃長(zhǎng)日照（16 h/8 h）條件下培養(yǎng)37 d，對(duì)其進(jìn)行表型觀察。

2結(jié)果與分析

2.1BraSDG2-RNAi片段的克隆

經(jīng)序列比對(duì)，選取一段長(zhǎng)度為258 bp的保守序列作為RNAi片段，命名為BraSDG2-RNAi，并成功克隆到該基因片段，見(jiàn)圖1。將克隆的目的片段與pMD19-T載體連接并導(dǎo)入感受態(tài)工程菌DH5α中，選取編號(hào)為13和16的兩個(gè)陽(yáng)性單菌落（圖2）送至公司測(cè)序。結(jié)果如圖3所示，目的

片段與預(yù)期片段比對(duì)，序列基本一致（5個(gè)位點(diǎn)的差異是由于本實(shí)驗(yàn)室所提供的白菜型油菜品種與白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)品種有所差異導(dǎo)致）。

2.2BraSDG2干擾載體的構(gòu)建

將BraSDG2-RNAi片段正反向插至目的載體pFGC5941上，結(jié)構(gòu)如圖4所示。通過(guò)酶切驗(yàn)證，確認(rèn)BraSDG2 RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi構(gòu)建成功，酶切后的片段大小與預(yù)期一致，如圖5所示。

2.3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

經(jīng)浸花法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（Col-0），通過(guò)100 mg/mL PPT篩選得到抗性苗并進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，獲得了1株轉(zhuǎn)基因植株。

2.4BraSDG2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

在相同長(zhǎng)日照條件下（16 h/8 h），對(duì)生長(zhǎng)37 d的T3、T4代 BraSDG2 RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與Col-0進(jìn)行觀察。相比Col-0，T4代BraSDG2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株（純合體）形態(tài)特征表現(xiàn)為植株矮小且出現(xiàn)敗育現(xiàn)象（圖7），其表型與擬南芥sdg2缺失突變體相近。

3討論與結(jié)論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，其作用機(jī)理是通過(guò)特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，間接影響基因表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要的生物學(xué)作用。擬南芥核組蛋白的賴氨酸殘基被甲基化常見(jiàn)的有4類， histoneH3lysine4（H3K4）、H3K9、H3K27、H3K36?，F(xiàn)有研究的基因組規(guī)模分析的結(jié)果顯示不同位點(diǎn)不同程度的甲基化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄異常，從而影響基因的表達(dá)[7-15]。

研究表明，擬南芥的大多數(shù)基因都存在組蛋白甲基化現(xiàn)象，其中發(fā)揮重要作用的就是組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT），這是一類包含130～150個(gè)氨基酸保守 SET結(jié)構(gòu)域的蛋白[16]，該保守結(jié)構(gòu)域也是其發(fā)揮催化作用的活動(dòng)中心。SDG蛋白家族都含有SET結(jié)構(gòu)域，擬南芥SDG2功能表現(xiàn)為特異性地催化組蛋白，對(duì)H3K4位點(diǎn)造成雙甲基化與三甲基化，從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[17]。

已有試驗(yàn)表明，對(duì)擬南芥SDG2進(jìn)行RNAi，會(huì)導(dǎo)致植株弱小、葉片變小、根長(zhǎng)變短、蓮座葉數(shù)目變少。本研究通過(guò)序列比對(duì)獲得白菜型油菜中與擬南芥SDG2同源的基因片段BraSDG2-RNAi，并構(gòu)建BraSDG2 RNA干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果表明構(gòu)建的載體可以有效干擾擬南芥SDG2基因的表達(dá)，BraSDG2 RNAi擬南芥轉(zhuǎn)基因純合植株表型與sdg2擬南芥突變體相似，都表現(xiàn)為植株矮小且育性極低，從而佐證了組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SDG2同系物在植物中是高度保守的。有研究顯示，擬南芥SDG2的缺失導(dǎo)致H3K4me3甲基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)劇烈下降，突變體具有強(qiáng)烈的多向性的表型以及許多基因的錯(cuò)誤調(diào)控，植株矮小和敗育就是其中重要的表型[18]。本試驗(yàn)證明了白菜型油菜中SDG2的同系物BraSDG2可能對(duì)H3K4me3甲基轉(zhuǎn)移酶具有相似的功能，該結(jié)果為進(jìn)一步研究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG家族的作用機(jī)制與白菜中BraSDG2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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