橡膠樹轉HbCBF1基因矮化突變體T—DNA插入位點研究

周權男 李季 孫愛花 華玉偉 黃華孫

摘 要 利用經(jīng)PCR、GUS染色和Southern雜交均證明已成功轉入HbCBF1的、田間表型為矮化的橡膠樹植株C1為材料，通過TAIL-PCR的方法獲得T-DNA右側側翼序列1.6 kb，根據(jù)側翼序列與載體的序列設計引物分析驗證該序列真實可靠，并設計引物判斷基因的T-DNA插入以雜合位點存在，與此同時，將該側翼序列與已有的橡膠樹基因組測序結果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該插入位點處并不存在基因，根據(jù)CBF1與CaMV35s啟動子的研究推測，C1植株的矮化表型是由于CaMV35s啟動子驅動抗逆基因導致，而非插入基因造成。

關鍵詞 HbCBF1；T-DNA；純合/雜合；矮化；橡膠樹

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The C1 plant transferred HbCBF1 successfully was used as the material， verified by PCR， GUS staining and Southern blot， the phenotype of C1 in the field was dwarf. Using the method of TAIL-PCR， we got the 1.6 Kb flanking sequence of T-DNA， combing with the sequence of vector pCAMBIA2301， we designed three pairs of primers to validate that the sequence was reliable， and judge that the insertion site of T-DNA was heterozygous. Meanwhile， we compared and analyzed the flanking sequence with the genome sequencing result of rubber， and found that there was no gene in the T-DNA insertion site. According to the study of CBF1 and CaMV35s promoter， we speculated that the dwarf phenotype of C1 was induced by the CBF1 gene driven by CaMV35s promoter， instead of the gene of T-DNA insertion.

Key words HbCBF1； T-DNA； Homozygosis / heterozygosis； Dwarf mutant； Hevea brasiliensis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.014

CBF/DREB（C-repeat-binding-factor / dehydration-responsive-element-binding）轉錄因子作為低溫、鹽堿脅迫和干旱應答的重要成分，經(jīng)脅迫誘導后，與下游基因啟動子的CRT/DRE（C-repeat / dehydration-responsive-element）元件結合，調節(jié)大量含有該元件的抗逆基因表達，從而增強植株對多種逆境的抵抗性[1-2]。但該轉錄因子在影響植株抗逆性的同時也會影響植株的生長，主要分為以下4種類型，分別是抗逆性提高，伴隨矮化[3-5]；抗逆性提高，非矮化[6-7]；抗逆性無明顯提高，伴隨矮化[8-9]和抗逆性無明顯提高，非矮化[10]等。對于矮化的機理方面研究者主要集中在植物激素[11]、啟動子[12-13]和外源基因調控相關基因的表達[14-15]等方面，但CBF/DREB轉基因植株的矮化可能是由上述某個或某幾個因素引起，也有可能有未知因素引起，目前仍沒有系統(tǒng)的、確鑿的證據(jù)闡釋矮化機理[16]。

T-DNA插入位點側翼序列的擴增方法主要有TAIL-PCR法（熱不對稱交錯PCR）、I-PCR法（反向PCR）和Plasmid rescue法（質粒挽救）等，其中TAIL-PCR法是僅使用PCR來擴增側翼序列的方法，具有簡單及高效性，尤其適用于大規(guī)模樣品未知序列的分離[17-18]。在植物基因組學研究中已建立一套較為完整的、穩(wěn)定的用于T-DNA插入獲得突變體側翼序列的方法體系[19-20]。

本研究以獲得的轉HbCBF1陽性植株C1為材料，采用TAIL-PCR的方法成功克隆到該植株T-DNA插入位點的側翼序列，根據(jù)該側翼序列與橡膠樹基因組進行比對，分析插入位點的相關信息，為揭示矮化表型奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹轉HbCBF1陽性植株C1（CaMV35s啟動子啟動HbCBF1，表達載體是pCAMBIA2301）和橡膠樹無性系熱研7-33-97，2011年11月定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質資源圃內。

PCR反應所需要的Taq酶購于Fermantas公司，pMDR-19T vector（Takara）、2 kb DNA Ladder和15 kb DNA Ladder和TAIL-PCR用的酶Ex TaqR購于大連寶生物公司。dNTP購于北京全式金生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購于OMEGA公司。DNA提取試劑盒購于TIANGEN公司（TIANGEN Cat. #DP320）。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹葉片基因組DNA提取 DNA提取過程詳見DNA提取試劑盒說明書，選擇材料為C1植株淡綠期葉片，50 μL滅菌蒸餾水洗脫。取2 μL電泳檢測提取DNA的質量，確保無明顯的蛋白質和RNA殘留后，分光光度計測濃度。

1.2.2 TAIL-PCR獲得側翼序列 將獲得的C1植株基因組DNA稀釋至50 ng/μL，按照Liu等[18]的方法稍加修改，第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為第二輪的模板，循環(huán)時高溫降低2 ℃，dNTP增加至1.6 μL，進行三輪擴增，擴增引物序列與Liu等[18]報道的序列一致，選擇清晰條帶挖膠，經(jīng)瓊脂糖回收試劑盒回收，與PMDR19-T vector連接，選擇至少2個菌液送至華大基因測序，去除連接載體序列后與pCAMBIA2301骨架載體序列進行比較。

1.2.3 側翼序列驗證 根據(jù)測序獲得的側翼序列，在pCAMBIA2301載體RB側的序列和側翼序列上分別設計一條引物，命名為3C-5F/R，片段大小為810 bp，擴增植株C1和橡膠樹無性系熱研7-33-97，用來驗證獲得的側翼序列是否為目標序列。根據(jù)獲得的側翼序列設計前后兩對引物，分別命名為3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R，擴增片段大小分別是808 bp和599 bp，用來擴增植株C1和橡膠樹無性系熱研7-33-97，獲得整個側翼序列，將上述獲得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman軟件去除載體序列后進行拼接，利用MUSLE軟件進行序列數(shù)據(jù)比對[21]，并用GeneDoc軟件可視化輸出。引物詳細序列見表1。

1.2.4 突變體T-DNA插入位點純合/雜合分析

在pCAMBIA2301載體的T-DNA區(qū)域靠近LB序列附近設計一條引物1-6-7-1R，距離LB 258 bp，在已獲得的LB處橡膠樹基因組序列上設計一條引物1-2F，該引物距離LB處350 bp，另外在已獲得的側翼序列上設計一條引物1-2R，距離獲得的側翼序列開頭65 bp。因此，將1-2F/R、1-2F/1-6-7-1R和1-2F/1-2R/1-6-7-1R分別進行擴增，其中1-2F/R在熱研7-33-97和雜合突變體中可以擴增出條帶，片段大小為415 bp（350 bp+65 bp），T-DNA插入純合突變體中無擴增產(chǎn)物；1-2F/1-6-7-1R在T-DNA插入突變體中可以擴增出條帶，其中突變體片段大小為608 bp（350 bp+258 bp），熱研7-33-97中無擴增產(chǎn)物；1-2F/1-2R/1-6-7-1R在純合突變體中擴增產(chǎn)物片段大小為608 bp（350 bp+258 bp），熱研7-33-97擴增產(chǎn)物片段大小為415 bp，在雜合突變中擴增的片段大小分別是415 bp和608 bp。

1.2.5 側翼序列與橡膠樹基因組比對及HbCBF1插入位點分析 將獲得的側翼序列與本單位已獲得的橡膠樹基因組序列進行比對，獲得該序列所在的scafford，并與其左右的基因組序列進行比較，最終確定該插入位點的情況。

2 結果與分析

2.1 HbCBF1轉基因陽性植株C1表型性狀觀察

C1植株定植2個月后，觀察表型發(fā)現(xiàn)，該植株較對照植株矮化，主要體現(xiàn)在節(jié)間距縮?。▓D1）。

2.2 橡膠樹葉片基因組DNA提取及TAIL-PCR側翼序列的獲得

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，本研究提取的DNA質量較高（圖2），可用于PCR分析。利用TAIL-PCR方法獲得該植株對應的側翼序列，經(jīng)3輪PCR擴增反應，選擇清晰的條帶進行挖膠回收測序（圖3），最終獲得1.654 kb的序列（LAD1-1/RB-2a第三輪擴增結果），其中206 bp與pCAMBIA2301載體的RB測得序列一致，因此剩余的1.448 kb為插入基因的序列。

2.3 側翼序列驗證及插入位點純合/雜合分析

本研究分別利用特異引物進行對擴驗證，結果發(fā)現(xiàn)，3C-5F/R在熱研7-33-97中無擴增產(chǎn)物，植株C1中擴增的序列測序后與TAIL-PCR獲得的序列一致（圖4），而3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R擴增熱研7-33-97和植株C1測序結果也與TAIL-PCR獲得的序列基本一致（圖5和圖6），因此，筆者認為該序列真實可靠。與此同時，利用載體與側翼序列的引物進行擴增（圖7），1-2F/1-6-7-1R僅在C1中有608 bp的擴增片段，熱研7-33-97中無擴增產(chǎn)物；1-2F/R在熱研7-33-97和C1中均存在415 bp的片段，可以初步判斷該插入位點為雜合；而三引物1-2F/1-2R/1-6-7-1R在熱研7-33-97中僅有415 bp的片段，在C1中有2條片段，分別是415 bp和608 bp，因此該T-DNA插入以雜合位點的形式存在。

2.4 HbCBF1插入位點分析

將獲得可靠的HBCBF1插入的基因序列與較完善的橡膠樹基因組序列進行比對發(fā)現(xiàn)，該插入位點距前一個scafford為53.584 kb，而距下一個scafford為4.152 kb，即便是有可能插入后一個基因的啟動子處，但是距離ATG前端4 kb處是不可能存在啟動子序列的，因此在這段區(qū)間內是不可能插入到基因的，其位置參考圖8所示。

3 討論

本研究的實驗材料是轉HbCBF1基因的陽性橡膠樹植株，由CaMV35s啟動子驅動該基因的表達，其表現(xiàn)為橡膠樹抗寒性未顯著提高，但出現(xiàn)植株矮化現(xiàn)象。因在研究CBF/DREB類基因時存在4種不同類型，其中存在抗寒性無明顯提高，但伴隨矮化的現(xiàn)象[16]，但在轉基因研究中，T-DNA的隨機插入可能會導致功能基因發(fā)生突變，進而發(fā)生矮化現(xiàn)象存在。

本研究先獲得T-DNA的側翼序列，然后通過比對獲得插入位點的信息，嘗試是否由于T-DNA插入功能基因后導致矮化的表型，如果插入功能基因處，那么也存在被插入基因可能導致矮化的可能。筆者通過TAIL-PCR的方法獲得T-DNA的側翼序列，與橡膠樹已經(jīng)獲得的全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，該插入位置并不存在基因，植株C1又是由CaMV35s啟動子驅動HbCBF1獲得的，而35s啟動子為植物強組成型啟動子，它驅動基因在植物不需要的情況下仍強烈表達，改變了植物正常的基因調控和代謝途徑，最終影響植物的生長發(fā)育，而脅迫誘導型啟動子rd29A，只有在植物受到逆境脅迫時才啟動基因的表達，因此可減小轉基因給植株帶來的負面影響[22-23]，因此推測造成矮化的表型并不是由插入位點所在的基因決定的，而是由35s啟動子驅動造成的。

早在1998年，Liu等[24]將水稻DREB1A基因轉入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)外源基因的導入并未增強抗性，反而植株出現(xiàn)了矮化。Hsieh等[25]將擬南芥的AtCBF1/DREB1A基因轉入番茄，也得到了相同的結果。洪波等[13]將擬南芥AtDREB1A基因以35S或rd29A啟動子在菊花中異源表達，與野生型相比，35S：DRBE1A轉基因植株在正常生長條件下嚴重的生長抑制，而rd29A：DREB1A植株生長狀況幾乎不產(chǎn)生影響，且耐脅迫能力高于前者。韋善軍等[26]研究了冷誘導基因的轉錄因子CBF1對植物抗寒性及生長發(fā)育的影響，玉米泛素啟動子驅動的CBF1基因增強煙草的抗寒性，但植株矮壯、葉片著生密集，延長營養(yǎng)生長期、推遲花期等。因此在對抗逆相關基因研究時最好采用rd29A等脅迫誘導啟動子或其他條件性啟動子啟動基因的表達，能增強植物抗逆性的同時，避免轉化植株出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象[9，27]。不過也有研究認為CBF1的組成型表達對擬南芥植株沒有顯著影響[28]。

為此筆者嘗試利用rd29A啟動子啟動HbCBF1，觀察轉基因植株的表型，進而確定啟動子對橡膠樹矮化性狀的影響。目前對CBF/DREB轉錄因子過量表達可使部分植株明顯矮化的機制尚不明確，諸多研究仍處于探索階段，其機理有待進一步探究。

參考文獻

[1] Gilmour S J， Fowler S G， Thomashow M F. Arabidopsis transcriptional activators CBF1， CBF2， and CBF3 have matching functional activities[J]. Plant Molecular Biology， 2004， 54： 767-781.

[2] Medina J， Catalá R， Salinas J. The CBFs： three Arabidopsis transcription factors to cold acclimate[J]. Plant Sci， 2011， 180： 3-11.

[3] Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors， DREB1 and DREB2， with an EREBP / AP2 DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low-temperature-responsive gene expression in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 1998， 10（8）： 1 391-1 406.

[4] Gilmour S J， Sebolt A M， Salazar M P， et al. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J]. Plant Physiol， 2000， 124（4）： 1 854-1 865.

[5] Ito Y， Katsura K， Maruyama K. Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice[J]. Plant and Cell Physiology， 2006， 47（1）： 141-153.

[6] Kasuga M， Liu Q， Miura S， et al. Improving plant drought salt， and freezing tolerance by gene transfer of a single stress inducible transcription factor[J]. Nat Biotechnol， 1999， 17： 287-291.

[7] Pellegrineschi A， Reynolds M， Pacheco M， et al. Stressinduced expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions[J]. Genome， 2004， 47： 493-500.

[8] Hsieh T H， Lee J T， Yang P T， et al. Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat /dehydration response element binding factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato[J]. Plant Physiol， 2002， 129（3）： 1 086-1 094.

[9] Kasuga M， Miura S， Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought and low temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer[J]. Plant Cell Physiology， 2004， 45（3）： 346-350.

[10] Dubozet J G， Sakuma Y， Ito Y， et al. OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought， high salt and cold responsive gene expression[J]. Plant J， 2003， 33（4）： 751-763.

[11] Tong Z， Hong B， Yang Y J， et al. Overexpression of two chrysanthemum DgDREB1 group genes causing delayed flowering or dwarfism in Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol， 2009， 71（1-2）： 115-129.

[12] Kizis D， Lumbreras V， Pages M. Role of AP2 / EREBP transcription factors in gene regulation during abiotic stress[J]. FEBS Lett， 2001， 498： 187-189.

[13] 洪 波， 仝 征， 馬 男， 等. AtDREB1A基因在菊花中的異源表達提高了植株對干旱和鹽漬脅迫的耐性[J]. 中國科學， 2006， 36（3）： 223-231.

[14] Maruyama K， Sakuma Y， Kasuga M， et al. Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems[J]. Plant Journal， 2004， 38（6）： 982-993.

[15] Oh S J， Song S I， Kim Y S， et al. Arabidopsis CBF3 /DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth[J]. Plant Physiology， 2005， 138： 341-351.

[16] 包永霞， 滿 達， 肖 波， 等. CBF/DREB轉錄因子與植物矮化的相關性研究進展[J]. 生物技術通報， 2011， 3： 7-11.

[17] Liu Y G and Whittier R F. Thermal asymmetric interlaced PCR： automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J]. Genomics， 1995， 25： 674-681.

[18] Liu Y G and Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques， 2007， 43， 649-650.

[19] Qin G J， Kang D M， Dong Y Y， et al. Obtaining and analysis of flanking sequences from T-DNA transformants of Arabidopsis[J]. Plant Science， 2003， 165： 941-949.

[20] 劉 慧， 劉貫山， 劉 峰， 等. 煙草T-DNA插入位點側翼序列擴增方法的篩選與優(yōu)化[J]. 中國煙草科學， 2014， 35（1）： 96-101， 107.

[21] Edgar R C. MUSCLE： multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Res， 2004， 32： 1 792-1 797.

[22] Dubouzet J G， S akuma Y， Ito Y， et al. OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought-， high-salt- and cold-responsive gene expression[J]. Plant J， 2003， 33： 751-763.

[23] 高 峰， 熊愛生， 彭日荷， 等. 抗逆相關DREB轉錄因子的研究進展及應用[J]. 上海農(nóng)業(yè)學報， 2008， 24（1）： 118-123.

[24] Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors， DREB1 and DREB2， with an EREBP / AP2 DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low-temperature-responsive gene expression in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 1998， 10（8）： 1 391-1 406.

[25] Hsieh T H， Lee J T， Yang P T， et al. Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat / dehydration response element binding factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato[J]. Plant Physiol， 2002， 129（3）： 1 086-1 094.

[26] 韋善軍， 孫振元， 巨關升， 等. 冷誘導基因轉錄因子CBF1的組成型表達對植物的抗寒性及生長發(fā)育的影響[J]. 核農(nóng)學報， 2005， 19（6）： 465-468.

[27] 張微微， 車代弟， 張 興， 等. CBF1轉錄因子基因的克隆及兩種啟動子調控下的植物表達載體的構建[J]. 分子植物育種， 2005， 3（4）： 493-497.

[28] Jaglo-Ottosen K R， Gilmour S J， Zarka D G， et al. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance[J]. Science， 1998， 280（5360）： 104-106.