荸薺組培苗在間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBs）中的高效增殖技術(shù)

高美萍 林志城 張馳 江文 董偉清 歐昆鵬 桂杰 閉志強(qiáng) 何芳練 陳麗娟

摘要：【目的】探討間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBs）對荸薺（Eleocharis dulcis）組培苗快速繁殖的效果，為提高荸薺組培苗繁殖效率及其工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳猿醮T導(dǎo)培養(yǎng)獲得的桂蹄2號荸薺組培苗為外植體，利用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行組培快繁，研究荸薺組培苗不同繼代代數(shù)、接種密度、激素組合及反應(yīng)器間歇浸沒頻率等因子對荸薺組培增殖的影響?！窘Y(jié)果】經(jīng)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4、5、6代繼代材料增殖倍數(shù)較高，其中第6代繼代苗增殖倍數(shù)最高，達(dá)31.1倍，到第7代后隨繼代代數(shù)的增加增殖倍數(shù)逐漸降低。當(dāng)接種密度大于15叢/瓶時，外植體污染率達(dá)16.0%；當(dāng)接種密度低于10叢/瓶時，外植體的污染率為0。低于10 min/6 h的間歇浸沒頻率有利于降低污染率，在6 h內(nèi)低于15 min的浸沒時間有利于降低玻璃化苗率；當(dāng)激素組合為3.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA時，組培苗增殖倍數(shù)達(dá)38.5倍，且組培苗生長正常。【結(jié)論】在TIBs系統(tǒng)中，采用經(jīng)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5代荸薺繼代組培苗，增殖培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖，pH 6.0，接種密度10叢/瓶，反應(yīng)器間歇浸沒頻率為10 min/6 h，可獲得較好的培養(yǎng)效果。

關(guān)鍵詞： 荸薺；組培苗；TIBs；高效增殖

中圖分類號： S645.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1653-05

0 引言

【研究意義】荸薺（Eleocharis dulcis）屬莎草科荸薺屬，又叫馬蹄、烏芋、通天草等，是我國原產(chǎn)的一種多年水生草本植物，其味甜多汁，肉質(zhì)松脆爽口消渣，是一種藥食兼用的果蔬。荸薺不僅是廣西名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品之一，還是我國傳統(tǒng)的重要出口創(chuàng)匯產(chǎn)品之一。傳統(tǒng)荸薺組織培養(yǎng)主要采用半固體培養(yǎng)，該方法在組織培養(yǎng)操作過程中需要大量的手工勞動，增殖率較低，是一種勞動密集型技術(shù)。因此，加強(qiáng)對荸薺組培快繁技術(shù)的研究，對于解決市場需求、實現(xiàn)荸薺組培苗工廠化生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】間歇浸沒式生物反應(yīng)系統(tǒng)是近20年來發(fā)明的一種用于植物組織快繁生產(chǎn)的系統(tǒng)，最先由Teisson改進(jìn)命名。該培養(yǎng)方式結(jié)合固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的優(yōu)點而舍棄其缺點，使培養(yǎng)材料達(dá)到最大增殖數(shù)（Alverd et al.，1993；Etienne and Berthouly，2002；Be and Debergh，2006；Benlal et al.，2008）。目前，國外利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBs）進(jìn)行組培快繁研究的植物品種較多，國內(nèi)利用該套系統(tǒng)進(jìn)行研究的作物品種也在不斷增多，其中在甘蔗上的研究報道較多。Lorenzo等（2001）利用TIBs系統(tǒng)對一個古巴甘蔗品種進(jìn)行組織培養(yǎng)，其一代增殖可達(dá)40倍，獲得的組培苗在田間的生長情況也較傳統(tǒng)方法獲得的組培苗適應(yīng)性好。Angela等（2009）將幾個澳大利亞甘蔗品種在不同生物反應(yīng)器中進(jìn)行試驗比較，發(fā)現(xiàn)利用TIBs系統(tǒng)的甘蔗組培苗一代增殖率超過20倍。在國內(nèi)，部分學(xué)者采用TIBs系統(tǒng)對甘蔗和香蕉進(jìn)行組培快繁研究。劉麗敏等（2009）利用TIBs系統(tǒng)對ROC16和ROC22兩個甘蔗品種進(jìn)行組培快繁研究，發(fā)現(xiàn)ROC16一代增殖率達(dá)40倍，ROC22一代增殖率為30倍。楊柳等（2011）以新臺農(nóng)22號莖尖脫毒組培苗為材料，研究了不同激素組合、間歇浸沒頻率、接種密度等因素對其在TIBs系統(tǒng)中增殖效果的影響，結(jié)果表明，該系統(tǒng)可使甘蔗組培一代增殖40倍以上。李鐵軍等（2012）以篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）叢生苗為材料，研究篤斯越橘在TIBs中的增殖效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種密度對篤斯越橘叢生苗增殖生長有重要影響，接種密度是重要的調(diào)控參數(shù)之一。【本研究切入點】目前，國內(nèi)利用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行組培快繁的植物品種主要有甘蔗和香蕉，未見應(yīng)用于水生蔬菜荸薺的相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究荸薺組培苗不同繼代代數(shù)、接種密度、激素組合及反應(yīng)器間歇浸沒頻率等因子對荸薺組培增殖的效果，優(yōu)化TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)荸薺組培苗的增殖技術(shù)，為提高荸薺組培苗繁殖效率及其工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供的經(jīng)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的健康荸薺組培苗（桂蹄2號）為試驗材料，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+ 30.0 g/L蔗糖。TIBs系統(tǒng)根據(jù)Lorenzo等（1998）的設(shè)計思路建立。TIBs系統(tǒng)中培養(yǎng)瓶和儲液瓶分別為2.5和3.0 L的廣口無色玻璃瓶和三角瓶，瓶高分別為26和30 cm，直徑為14和15 cm。儲液瓶中液體培養(yǎng)基體積為1.0 L。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 不同代數(shù)繼代組培苗對TIBs系統(tǒng)組培的影響

分別以繼代培養(yǎng)2～8代的組培苗為試驗材料，增殖培養(yǎng)基為傳統(tǒng)荸薺增殖培養(yǎng)基，即MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+30.0 g/L蔗糖，pH 5.8～6.0，TIBs系統(tǒng)間歇浸沒頻率為10 min/3 h，接種密度為10叢/L（每15顆芽為1叢）。

1. 2. 2 不同接種密度在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果 在試驗1.2.1基礎(chǔ)上，以第5代繼代組培苗為材料，培養(yǎng)基配方及TIBs條件同1.2.1，組培苗接種密度設(shè)置為5、10、15和20叢/L。

1. 2. 3 不同間歇浸沒頻率對TIBs系統(tǒng)組培的影響

在試驗1.2.2基礎(chǔ)上以第5代繼代組培苗為試驗材料，增殖培養(yǎng)基配方同上，接種密度10叢/L，TIBs系統(tǒng)間歇浸沒頻率設(shè)為10 min/3 h、10 min/6 h、10 min/12 h和10 min/24 h，共4個處理。

1. 2. 4 不同浸沒時間對TIBs系統(tǒng)組培的影響 在試驗1.2.3基礎(chǔ)上以第5代繼代組培苗為試驗材料，增殖培養(yǎng)基配方同上，接種密度10叢/L，TIBs系統(tǒng)設(shè)組培苗在培養(yǎng)液中浸沒時間為5、10、15、20和30 min/6 h，共5個處理。

1. 2. 5 不同激素組合對TIBs系統(tǒng)組培的影響 在試驗1.2.4基礎(chǔ)上以第5代繼代組培苗為試驗材料，接種密度為10叢/L，間歇浸沒頻率為10 min/6 h，6-BA濃度梯度設(shè)為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/L，NAA濃度設(shè)為0.01和0.05 mg/L，共10個處理。

以上各試驗培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1500 lx，培養(yǎng)溫度（28±2）℃，光照16 h/d，黑暗8 h/d。增殖培養(yǎng)40 d。試驗均設(shè)每處理3套TIBs系統(tǒng)，重復(fù)2次，取平均值。

1. 3 統(tǒng)計分析

接種后每周觀察記錄1次生長狀況，40 d后計算每瓶組培苗叢數(shù)，數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0的SNK法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同代數(shù)荸薺繼代組培苗在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果

將經(jīng)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的第2～8代荸薺組培苗轉(zhuǎn)接到TIBs系統(tǒng)中培養(yǎng)，增殖效果見表1。經(jīng)過40 d培養(yǎng)后，第4、5、6代繼代組培苗增殖倍數(shù)較高，其中第6代繼代組培苗增殖倍數(shù)最高，為31.1倍；到第7代增殖倍數(shù)開始下降，第8代增殖倍數(shù)降到最低，為22.6倍。隨著繼代苗代數(shù)的增加，組培苗增殖的時間推遲，第4、5、6、7代差異不顯著（P>0.05，下同），均在6.0 d左右開始增殖。因此，為了保證材料的充足且不影響增殖倍數(shù)，利用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行荸薺組培苗快繁以第5代材料最佳。

2. 2 不同接種密度在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果

選用第5代繼代組培苗，研究不同接種密度對荸薺組培快繁效果的影響，結(jié)果見表2。隨著接種密度的增加，增殖芽數(shù)也逐漸增多，但培養(yǎng)基污染風(fēng)險加大，當(dāng)接種密度大于15叢/瓶時污染率達(dá)16.0%，而低于10叢/瓶的接種密度外植體的污染率得到有效控制。因此，為達(dá)到低污染高增值的培養(yǎng)效果，選擇10叢/瓶用于后續(xù)試驗研究。

2. 3 不同間歇浸沒頻率在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果

間歇浸沒頻率是TIBs系統(tǒng)的重要調(diào)控因素之一。選用第5代繼代組培苗、接種密度10叢/瓶，研究間歇浸沒頻率對荸薺組培快繁效果的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，隨著間歇浸沒頻率的延長，組培苗的污染率上升，當(dāng)間歇浸沒頻率達(dá)10 min/12 h后污染率明顯增加，植株的生長勢也較差；增殖倍數(shù)隨著間歇浸沒頻率的延長而降低，當(dāng)間歇浸沒頻率為10 min/3 h和10 min/24 h時，芽增殖倍數(shù)分別達(dá)到最高32.1倍及最低24.4倍；當(dāng)間歇浸沒頻率為10 min/3 h和10 min/6 h時，芽增殖倍數(shù)均在30.0倍以上。由此可見，短時間的間歇浸沒有利于荸薺植株的生長，提高荸薺組培苗的增殖率和降低污染率。本研究適宜的間歇浸沒頻率為10 min/6 h以下。

2. 4 不同浸沒時間在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果

由表4可知，隨著浸沒時間的增加，組培苗芽的增殖倍數(shù)逐漸增加，其中，每6 h浸沒30 min的增殖倍數(shù)最高，為34.8倍。SNK法分析結(jié)果表明，浸沒20 min與浸沒30 min的增殖倍數(shù)間差異不顯著，浸沒5、10、15 min與浸沒20、30 min的增殖倍數(shù)間差異顯著（P<0.05，下同）；延長浸沒時間對組培苗生長勢有促進(jìn)作用；當(dāng)浸沒時間超過20 min 時組培苗出現(xiàn)玻璃化苗，玻璃化率為27.0%，浸沒時間為30 min時玻璃化率為34.0%（表4）。為了控制組培苗的變異率，生產(chǎn)上在6 h內(nèi)采用15 min以下的浸沒時間有利于組培苗的正常生長。

2. 5 不同激素組合對荸薺組培苗增殖的影響

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，將組培誘導(dǎo)的第5代繼代苗、接種密度10叢/瓶、間歇浸沒頻率采用10 min/6 h，轉(zhuǎn)接至含不同濃度6-BA和NAA組合的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d左右時基部長出新芽，25 d后可見1 cm長的新芽，30～40 d內(nèi)新芽增長速度最快。從表5可以看出，芽的增殖倍數(shù)隨著6-BA濃度的增加而逐漸上升，在4.0 mg/L 6-BA條件下培養(yǎng)基添加0.05和0.01 mg/L NAA，芽的增殖倍數(shù)最高，分別為37.7和42.6倍；當(dāng)NAA為0.05 mg/L時，6-BA為1.0 mg/L與1.5、2.0、3.0、4.0 mg/L的增殖倍數(shù)差異顯著，而2.0與3.0 mg/L、2.0與4.0 mg/L間的增殖倍數(shù)差異不顯著；當(dāng)NAA為0.01 mg/L時，6-BA為3.0與4.0 mg/L間增殖倍數(shù)差異不顯著，其他處理間增殖倍數(shù)差異均顯著；NAA 0.01 mg/L較0.05 mg/L更有利于芽的分蘗，增殖倍數(shù)更多，但植株較細(xì)，長勢稍遜。試驗還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA達(dá)到4.0 mg/L時出現(xiàn)叢生苗，苗細(xì)弱，緊密成一簇。為降低組培苗變異率，在保證組培苗質(zhì)量的同時擁有較高的增殖倍數(shù)，以3.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA最佳，在該條件下組培苗增殖倍數(shù)可達(dá)38.5倍。

3 討論

本研究通過對荸薺組培苗在TIBs系統(tǒng)中繼代增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到采用經(jīng)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)到第5代繼代組培苗、接種密度10叢/瓶、培養(yǎng)基激素組合3.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA、間歇浸沒頻率10 min/6 h，組培苗增殖達(dá)38.5倍。杭玲等（2005，2007）利用荸薺莖尖分別進(jìn)行固體和液體組織快繁培養(yǎng)，結(jié)果表明，固體培養(yǎng)一代繼代增殖3～4倍，液體培養(yǎng)一代繼代增殖6～8倍，而本研究采用的TIBs系統(tǒng)組培增殖倍數(shù)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)固體和液體培養(yǎng)方法。Alverd等（1993）利用該系統(tǒng)對香蕉（Musa AAB）進(jìn)行組培快繁研究，發(fā)現(xiàn)一代增殖率達(dá)30倍，其原因可能與TIBs系統(tǒng)有良好的氣體交換環(huán)境有關(guān)；同時，培養(yǎng)基的循環(huán)利用可充分利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分而有效防止?fàn)I養(yǎng)沉積和有害物質(zhì)積累（Aitken-Christie and Jones，1987）。

大量研究表明，使用不同代數(shù)的繼代苗為外植體，其組培苗的生長、增殖等狀況不同。楊柳等（2011）在利用TIBs進(jìn)行甘蔗組培快繁研究時發(fā)現(xiàn)，以第4代甘蔗繼代苗為接種材料最有利于甘蔗組培苗的增殖和生長；粟靖（2011）研究發(fā)現(xiàn)，以第7代香蕉不定芽為試驗材料時，香蕉的生長和增殖效果最好。本研究利用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行荸薺組培苗快繁研究，選用第5代繼代組培苗最理想。

間歇浸沒頻率和間歇浸沒時間是影響植物組培快繁的關(guān)鍵因素之一，其直接影響外植體的呼吸和對營養(yǎng)的吸收（Shepherd and Silva，1996）。不同作物品種間最佳間歇浸沒頻率和浸沒時間差異明顯。Roels等（2005）研究表明，間歇浸沒頻率和浸沒時間為20 min/h最有利于香蕉增殖；Angela等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，間歇浸沒頻率和浸沒時間為1 min/24 h對甘蔗品種Q165和Q117的增殖效果較好。本研究結(jié)果表明，荸薺組培苗的間歇浸沒頻率和浸沒時間為10 min/6 h時增殖效果較好?？梢姡煌魑锲贩N芽的增殖倍數(shù)與間歇浸沒頻率、浸沒時間相關(guān)，具體原因有待對組培苗代謝及代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入探討后才能確定。本研究中在6 h內(nèi)間歇浸沒時間低于15 min均未見玻璃化苗，浸沒時間超過15 min則易出現(xiàn)玻璃化苗，具體引起玻璃化苗的原因有待進(jìn)一步研究。另外，TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)由于營養(yǎng)液富集，容易造成污染，培養(yǎng)中要嚴(yán)格篩選繼代材料，避免細(xì)菌或霉菌類的污染材料接入培養(yǎng)瓶。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行荸薺組培苗快繁，適宜增殖生長的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+

0.01 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖，pH 6.0，取第5代繼代組培苗，接種密度10叢/L，間歇浸沒頻率10 min/6 h，繼代增殖倍數(shù)可達(dá)38.5倍。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）