河南雞公山小魚(yú)仙草揮發(fā)油的抑菌作用及組分分析

陳利軍 陳月華 周巍 尹健 胡孔峰 楊俊杰

摘要：【目的】明確河南雞公山產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油的抑菌活性，掌握其化學(xué)組分，為小魚(yú)仙草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)水蒸氣蒸餾法提取采自河南雞公山的小魚(yú)仙草揮發(fā)油，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定揮發(fā)油對(duì)4種植物病原真菌（番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌和萵苣菌核病菌）的熏蒸抑制作用，并用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）分析揮發(fā)油的化學(xué)組分。【結(jié)果】小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)供試4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，半最大效應(yīng)濃度（EC50）均低于10.00 μL/皿；GC-MS法從小魚(yú)仙草揮發(fā)油中共分離出22個(gè)組分，鑒定了20個(gè)組分，占揮發(fā)油總量的98.822%；揮發(fā)油的主要組分為桉樹(shù)腦（64.684%）、β-蒎烯（7.963%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（5.239%）和β-水芹烯（4.673%）等?！窘Y(jié)論】河南雞公山產(chǎn)小魚(yú)仙草的揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，可作為熏蒸劑應(yīng)用于植物病害防控。

關(guān)鍵詞： 小魚(yú)仙草；揮發(fā)油；抑菌作用；GC-MS分析；雞公山

中圖分類(lèi)號(hào)： S432.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1875-05

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical references for development and applocation of Mosla dianthera， the antifungal activity and chemical constituents of essential oil from M. dianthera in Jigong Mountain of Henan were investigated. 【Method】Essential oil was extracted from M. dianthera by steam distillation， and through fumigation， its inhibitory effects on four plant pathogenic fungi namely Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum were studied by determining growth rate. Meanwhile， chemical constituents of essential oil were analyzed by GC-MS. 【Result】Essential oil from M. dianthera showed strongly inhibitory effect on growth of four target plant pathogenic fungi， and its 50% effective concentration（EC50） was less than 10 μL/dish. Twenty-two chemical constituents were isolated from essential oil， and 20 of which were identified， accounting for 98.822% of total essential oil. The main chemical constituents of essential oil were eucalyptol（64.684%）， β-pinene（7.963%）， 1，3，6-octatriene，3，7-dimethyl-，（Z）-（5.239%）， and β-phellandrene（4.673%） etc. 【Conclusion】Through fumigation， essential oil from M. dianthera in Jigong Mountain of Henan shows strongly inhibitory effect on plant pathogenic fungi， which is used as a fumigant for controlling plant disease in the future.

Key words： Mosla dianthera； essential oil； antifungal activity； GC-MS analysis； Jigong Mountain

0 引言

【研究意義】植物揮發(fā)油又稱精油，是從植物中分離提取的有特征香氣的一類(lèi)次生代謝物質(zhì)，為具有揮發(fā)性的油狀液體（徐漢虹，2001）。植物揮發(fā)油化學(xué)成分多樣，同一植物不同產(chǎn)地、生育期、部位等揮發(fā)油組分存在明顯差異（陳利軍等，2014）。一些植物的揮發(fā)油具有抑菌活性，結(jié)合其易揮發(fā)的特性可作為倉(cāng)儲(chǔ)、設(shè)施農(nóng)業(yè)、土壤等的熏蒸劑，防控病、蟲(chóng)、線蟲(chóng)等的為害（陳利軍等，2014；陳飛等，2015），且具有高效、低毒、環(huán)保等特點(diǎn)，是理想的綠色生物熏蒸劑（王昌祿等，2014）。唇形科植物小魚(yú)仙草[Mosla dianthera（Buch.Ham.）Maxim]又名疏花薺苧、野香薷、假荊芥等，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域及以南，全草入藥，民間常用于治療感冒發(fā)熱、中暑頭痛、皮炎、濕疹及滅蚊等（吳征鎰和李錫文，1977）。小魚(yú)仙草全株含豐富的揮發(fā)油，因此研究其揮發(fā)油的化學(xué)組分及抑菌活性，對(duì)有效開(kāi)發(fā)利用小魚(yú)仙草資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有一些對(duì)小魚(yú)仙草揮發(fā)油化學(xué)組分分析的研究報(bào)道。蘭瑞芳（2000）報(bào)道福建高蓋山產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油的主要化學(xué)組分為石竹烯、葎草烯、叩巴烯、香橙烯、洋芹子油腦、欖香脂素等。林文群和陳忠（2002）研究報(bào)道了福建省福清市和福州市兩地的小魚(yú)仙草揮發(fā)油化學(xué)組分，兩地?fù)]發(fā)油主要組分種類(lèi)差異明顯。毛紅兵等（2012）報(bào)道浙江溫州產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油主要組分有異丁香烯、二環(huán)庚烯和環(huán)己烯。Wu等（2012）報(bào)道產(chǎn)自浙江浦江的小魚(yú)仙草揮發(fā)油主要組分為欖香脂素、麝香草酚、β-石竹烯、異欖香脂素、細(xì)辛腦、α-石竹烯等，并測(cè)定了揮發(fā)油的抗流感病毒活性。【本研究切入點(diǎn)】雞公山位于河南省最南端，為亞熱帶向暖溫帶的過(guò)度地段，地處我國(guó)南北的分水嶺，物種豐富。小魚(yú)仙草在雞公山較常見(jiàn)，但目前尚未有關(guān)于其揮發(fā)油組分及抑菌活性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用水蒸氣蒸餾法提取采自河南雞公山的小魚(yú)仙草揮發(fā)油，以4種植物病原真菌為目標(biāo)菌，測(cè)定小魚(yú)仙草揮發(fā)油的熏蒸抑菌活性，并采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）分析揮發(fā)油的化學(xué)組分，以期為小魚(yú)仙草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試小魚(yú)仙草全草于2015年7月下旬采自河南省信陽(yáng)市雞公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，帶回室內(nèi)后自然陰干。供試植物病原真菌菌株：番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和萵苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）均由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水10000 mL）。主要儀器設(shè)備： Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀，NIST05譜庫(kù)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 揮發(fā)油提取 陰干的小魚(yú)仙草剪為短于0.5 cm的小段，然后采用水蒸氣蒸餾法（陳利軍等，2014）連續(xù)提取2 h，得到淺黃色具濃郁氣味的油狀液體，即為小魚(yú)仙草揮發(fā)油。揮發(fā)油4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 揮發(fā)油熏蒸抑菌作用測(cè)定 將植物病原真菌置于PDA培養(yǎng)基上22 ℃下培養(yǎng)2～3 d后，用打孔器在菌落邊緣打取若干直徑5 mm的菌餅。熏蒸抑制作用測(cè)定采用陳利軍等（2014）的生長(zhǎng)速率法，揮發(fā)油劑量根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)置。將皿底皿蓋對(duì)扣后用Parafilm封口膜密封，22 ℃培養(yǎng)，48 h后觀察水稻紋枯病菌和萵苣菌核病菌的生長(zhǎng)情況，72 h后觀察番茄灰霉病菌和小麥赤霉病菌的生長(zhǎng)情況，并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。對(duì)照僅放一張濾紙片不滴加揮發(fā)油。重復(fù)3次。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100

按照武懷恒等（2014）的方法在Excel 2007上擬合毒力回歸方程。

1. 2. 3 揮發(fā)油GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱為HP-5 MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫，柱初溫60 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫速率升至90 ℃，再 以10 ℃/min升溫速率升至180 ℃，載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制作用

河南雞公山產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)供試4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸作用及毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和表2，根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（EC50）。結(jié)果表明，小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)4種植物病原真菌均有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，EC50均低于10.00 μL/皿，其中對(duì)水稻紋枯病菌的抑制活性最強(qiáng)，EC50僅為3.73 μL/皿。

2. 2 小魚(yú)仙草揮發(fā)油組分GC-MS分析結(jié)果

GC-MS分析小魚(yú)仙草揮發(fā)油化學(xué)組分的總離子流，結(jié)果見(jiàn)圖1。利用色譜峰面積歸一法測(cè)得各組分的相對(duì)含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，從小魚(yú)仙草揮發(fā)油中共分離出22個(gè)組分（表3），鑒定出20個(gè)組分，占揮發(fā)油總量的98.822%。

從表3可看出，小魚(yú)仙草揮發(fā)油的主要化學(xué)組分為桉樹(shù)腦（64.684%）、β-蒎烯（7.963%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（5.239%）、β-水芹烯（4.673%）等。

在鑒定的20種化合物中，以萜類(lèi)化合物為主，其中倍半萜類(lèi)化合物最多（10種），但相對(duì)含量少，僅占揮發(fā)油總量的7.602%；其次是單萜類(lèi)化合物（9種），占揮發(fā)油總量的90.185%，是揮發(fā)油的主要化合物質(zhì)種類(lèi)；另有1種酮類(lèi)化合物，占揮發(fā)油總量的1.035%。19種萜類(lèi)化合物中有萜烯類(lèi)17種，占揮發(fā)油總量的32.815%。

3 討論

植物揮發(fā)油的化學(xué)成分一般分為4類(lèi)：萜類(lèi)化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物（馮武， 2006；林立等，2015；吳恒等，2015）。在這些大量的化合物組分中，小分子的酚類(lèi)物質(zhì)、萜烯類(lèi)物質(zhì)和醛酮類(lèi)物質(zhì)是主要的抑菌有效成分（李亞茹等， 2014）。采自河南雞公山的小魚(yú)仙草揮發(fā)油主要化合物種類(lèi)為萜類(lèi)，在被鑒定的20種化合物中，萜類(lèi)有19種，其中萜烯類(lèi)17種，占揮發(fā)油總量的32.815%。小魚(yú)仙草中相對(duì)含量最高的化合物為桉樹(shù)腦，占64.684%，已有研究表明桉樹(shù)腦具有顯著的抑菌活性（孟雪等， 2010）。本研究中小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)供試4種植物病原真菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，EC50均低于10.00 μL/皿，證實(shí)小魚(yú)仙草揮發(fā)油具有顯著的抑菌活性，因此，利用小魚(yú)仙草揮發(fā)油的顯著抑菌活性有望研發(fā)出熏蒸劑應(yīng)用于植物病害防控。有關(guān)小魚(yú)仙草揮發(fā)油單體組分的熏蒸抑菌活性、組分間互作及主要成分桉樹(shù)腦在抑菌活性中的具體作用有待進(jìn)一步研究。

本研究中，河南雞公山產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油的主要化學(xué)組分為桉樹(shù)腦及β-蒎烯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、β-水芹烯等，與浙江（毛紅兵等，2012；Wu et al.，2012）、福建（蘭瑞芳，2000；林文群和陳忠，2002）等地產(chǎn)小魚(yú)仙草揮發(fā)油的主要化學(xué)組分有所不同，可能是由于產(chǎn)地不同（林文群和陳忠， 2002），不同的生境對(duì)植物揮發(fā)油成分的生物合成過(guò)程造成影響所致。

4 結(jié)論

本研究采用GC-MS從河南雞公山產(chǎn)小魚(yú)仙草提取的揮發(fā)油中共分離出22個(gè)組分，鑒定了20個(gè)組分，主要組分為桉樹(shù)腦、β-蒎烯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、β-水芹烯等。小魚(yú)仙草揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，可作為熏蒸劑應(yīng)用于植物病害防控。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）