高效液相色譜法測(cè)定食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素以及香豆素的研究

管淑霞，林新傳，都 穎

（食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東威海 264400）

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素都具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香，其中乙基香蘭素香氣更是香蘭素的3 ～4 倍，且留香持久[1]。這幾種香料用途廣泛，主要起增香和定香作用，廣泛用于食品、日用化妝品、煙草等行業(yè)[2]。香豆素一般存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香莢蘭和蘭花中，具有新鮮干草香和香豆香，但一般不作食用，允許煙用和外用。據(jù)歐盟專家委員會(huì)2000 年2 月24 日?qǐng)?bào)道，人體大量攝入香蘭素等食品添加劑可導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐和呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重的可能會(huì)損傷肝、腎[3]。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中允許使用的食品用合成香料名單有1 477種，其中包括香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素，食品分類中約有28 種食品沒有加香的必要，不得添加食品用香料、香精。標(biāo)準(zhǔn)中也明確規(guī)定了較大嬰兒和幼兒配方食品中可使用香蘭素、乙基香蘭素，最大使用量均為5 mg/100 mL；嬰幼兒谷類輔助食品中可使用香蘭素，最大使用量為7 mg/100 g，其中100 g和100 mL 都以即食食品計(jì)，是生產(chǎn)企業(yè)按照沖調(diào)比例折算成食品中的使用量；而使用范圍涵蓋0 ～6個(gè)月嬰幼兒配方食品不得添加任何食品用香料[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方乳粉、牛奶糖、飲料，均購(gòu)自本地超市；香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（C8H8O3，CAS 號(hào)121-33-5，天津阿爾塔科技有限公司，編號(hào)S087267，100 μg/mL）；甲基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（C9H10O3，CAS 號(hào)120-14-9，天津阿爾塔科技有限公司，編號(hào)S078875，100 μg/mL）；乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（C9H10O3，CAS 號(hào)121-32-4，天津阿爾塔科技有限公司，編號(hào)S086815，100 μg/mL）；香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（C9H6O2，CAS 號(hào)91-64-5，天津阿爾塔科技有限公司，編號(hào)S077371，100 μg/mL）；甲醇；乙腈（色譜純）；有機(jī)系微孔濾膜（孔徑0.45 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測(cè)器），Agilent；QUINTIX224-1CN電子天平，德國(guó)賽多利斯；V4DS025 渦旋混合器，德國(guó)艾卡；G-16C 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賽多利斯；氮?dú)鉂饪s裝置；超聲波發(fā)生器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

（1）甲醇-水溶液（4+1）。將甲醇400 mL 和水100 mL 混合均勻。

（2）鹽酸溶液（1 mol/L）。吸取8.33 mL 濃鹽酸，定容至100 mL 水中，臨用現(xiàn)配。

1.3.2 試樣制備及測(cè)定

將牛奶糖粉碎，飲料搖勻備用，乳粉直接用于試樣提取。稱取1.00 g 試樣，嬰幼兒配方乳粉加入10 mL 水和480 μL 鹽酸溶液，糖果及飲料加入5 mL水，溶解，渦旋振蕩1 min，加入乙腈20 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min 后，加入氯化鈉5 g，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min，離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管，40 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL 甲醇-水溶液溶解殘?jiān)?，過0.45 μm 微孔濾膜后，待測(cè)[5]。

將試樣溶液注入高效液相色譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的濃度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

吸取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素 標(biāo) 準(zhǔn) 液（100 μg/mL）各1 mL 混 合成25 μg/mL 的溶液，-18 ℃避光保存，保存期3 個(gè)月。分別吸取適量25 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液8 μL、40 μL、200 μL、400 μL 和1 000 μL，用甲醇-水溶液定容至1 mL，配成濃度為0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL 和25.0 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：279 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A 相為0.5%甲酸溶液，B 相為乙腈；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及檢出限

在1.3.4 色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行測(cè)定，得到4 種化合物的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)及回歸方程，在3 倍信噪比的進(jìn)樣濃度水平下計(jì)算檢出限。在0.2 ～25.0 μg/mL，香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的峰面積均與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，檢出限為0.05 ～0.07 mg/kg，結(jié)果如表2 所示。

表2 4 種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

以不含香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的奶粉為空白樣品基質(zhì)，分別計(jì)算0.1 mg/kg、0.2 mg/kg 和0.3 mg/kg 3 個(gè)加標(biāo)水平下4 種化合物的回收率。4 種化合物的加標(biāo)回收率為96.1%～108.7%，結(jié)果如表3 所示。

表3 4 種化合物的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

用樣品加入0.1 mg/kg 混合標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行檢測(cè)，得出精密度為1.27%～3.00%，結(jié)果如表4 所示。

表4 4 種化合物的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 食品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)市售的幾種嬰幼兒乳粉、牛奶糖、飲料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5 所示。除嬰幼兒配方乳粉、酸奶外，其他幾款食品都在配料上標(biāo)注添加了食用香精。通過表5 能看出部分食品都不同程度地檢測(cè)出了香蘭素與乙基香蘭素，由于未設(shè)定限量，各類食品添加量也不同，往往奶香味越足的食品香精含量也越高。

表5 市售食品4 種香精的檢測(cè)結(jié)果（單位：mg/kg）

3 結(jié)論與討論

有研究表明，香蘭素、乙基香蘭素的少量攝入對(duì)人體沒有危害，但對(duì)于6 個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒來說，可能會(huì)破壞他們的食欲。嬰幼兒的身體器官未發(fā)育成熟，代謝排毒能力較差，攝入含有食品添加劑的食物會(huì)加重其日常代謝的負(fù)擔(dān)。過多攝入，還可能會(huì)造成偏食、厭食、挑食等問題，養(yǎng)成不良的飲食習(xí)慣。市售的多種奶味飲品、糖果均檢測(cè)出香蘭素，兩款飲品檢測(cè)出乙基香蘭素，因此要注意不要過早給嬰幼兒食用各種飲品。本文參照GB 5009.284—2021采用高效液相色譜法測(cè)定食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好、方法的檢出限及回收率符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，能滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素以及香豆素的檢測(cè)要求，可以為有關(guān)市場(chǎng)監(jiān)管部門加強(qiáng)嬰幼兒乳粉中香精檢測(cè)提供技術(shù)支持。