動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)的研究進(jìn)展

張冬冬 蘇超 洪偉 李莎 張廷廷

摘 要：抗生素濫用現(xiàn)象在動(dòng)物源食品的生產(chǎn)加工中較為嚴(yán)重，因此抗生素殘留檢測(cè)是食品質(zhì)量安全的重要內(nèi)容。該文綜述了動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)的研究進(jìn)展，梳理了各類(lèi)檢測(cè)技術(shù)并對(duì)技術(shù)的適用性進(jìn)行了分析，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向提出了建議。

關(guān)鍵詞：獸藥；抗生素；氟喹諾酮；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) TS207.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）13-0038-04

氟喹諾酮類(lèi)藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs），又稱(chēng)吡啶酮酸類(lèi)、沙星類(lèi)，屬于含氟第三代喹諾酮類(lèi)化學(xué)合成抗生素。其抗菌作用機(jī)制是：抑制細(xì)菌DNA螺旋酶，阻礙DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)與重組，對(duì)G-菌、G+菌均有抗菌活性，對(duì)衣原體、支原體也有一定抗菌作用。目前世界上已經(jīng)有十幾種FQs類(lèi)藥物上市（其中甲磺酸達(dá)氟沙星、鹽酸二氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星是專(zhuān)門(mén)的獸用抗生素），并有數(shù)十種新型FQs類(lèi)藥物處于研發(fā)中[1]，在動(dòng)物性食品的生產(chǎn)過(guò)程中，美國(guó)已經(jīng)禁用氟喹諾酮類(lèi)藥物，日本、歐盟與我國(guó)雖未禁用，但規(guī)定了限用種類(lèi)和最高殘留限量[2]。雖然我國(guó)農(nóng)業(yè)部先后發(fā)布了《獸藥停藥期規(guī)定》[3] 和《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》等相關(guān)法規(guī)[4]，但是由于從業(yè)人員缺乏相應(yīng)知識(shí)而造成藥物的過(guò)量使用及不遵循休藥期，甚至片面地追求經(jīng)濟(jì)利益，在飼料生產(chǎn)、動(dòng)物養(yǎng)殖、食品加工等環(huán)節(jié)中濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，其結(jié)果，一方面導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，另一方面FQs藥物殘留可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，可損害內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)[5]。由于我國(guó)對(duì)獸藥濫用和危害的重視起步較晚，相關(guān)監(jiān)管落實(shí)不嚴(yán)，需要通過(guò)檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，來(lái)構(gòu)筑監(jiān)測(cè)和防控抗生素濫用的健康防線。下面將氟喹諾酮類(lèi)藥物檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行梳理歸納。

1 我國(guó)現(xiàn)行的氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

查閱國(guó)標(biāo)和農(nóng)業(yè)部的現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)我國(guó)現(xiàn)行的FQs殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分析如下：

（1）《GB/T 21312-2007動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[6]，要求使用固相萃取方法（SPE）進(jìn)行前處理，并使用液質(zhì)聯(lián)用（HPLC/MS/MS）進(jìn)行檢測(cè)。該法檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、檢測(cè)限低、可定性、定量，但儀器要求高、過(guò)程耗時(shí)、步驟繁瑣、影響回收率因素多、檢測(cè)成本昂貴等問(wèn)題，在日常檢測(cè)過(guò)程中很難加以應(yīng)用，適合作為殘留驗(yàn)證參考。

（2）《農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14-2008動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)—高效液相色譜法》提供的方法[7]，同樣是使用SPE方法進(jìn)行前處理，使用HPLC（配熒光檢測(cè)器）進(jìn)行檢測(cè)。該法檢測(cè)限低、靈敏度高，降低了儀器要求，但同樣存在過(guò)程耗時(shí)、步驟繁瑣、影響回收率因素多、需專(zhuān)用的一次性SPE柱，檢測(cè)成本較高等問(wèn)題。

（3）《農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-8-2008動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)—酶聯(lián)免疫吸附法》[8]采用常規(guī)萃取分離方法進(jìn)行前處理，使用酶聯(lián)免疫法（競(jìng)爭(zhēng)性Elisa）進(jìn)行檢測(cè)。該法檢測(cè)的特異性強(qiáng)、儀器要求低，但存在交叉反應(yīng)，無(wú)法準(zhǔn)確定量、檢測(cè)限、定量限高、試劑盒（條）質(zhì)量批次差異大、競(jìng)爭(zhēng)性Elisa容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象等問(wèn)題。

2 國(guó)內(nèi)外氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)方法及進(jìn)展

2.1 微生物法 微生物法操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，但是對(duì)FQs藥物檢測(cè)的靈敏度低，并且具有選擇性，用微生物法檢出的陽(yáng)性樣品，還需其他檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)效率不高，僅適合大規(guī)模樣品的現(xiàn)場(chǎng)初篩使用。

微生物法對(duì)FQs藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)第一步就是要篩選合適的敏感菌，目前各國(guó)藥典所收錄的抗生素菌種主要有藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌等[9]。檢測(cè)樣品可以直接作用于敏感菌，或常規(guī)萃取方法獲得樣品提取液，再對(duì)其進(jìn)行敏感菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，具體的檢測(cè)方法包括：杯碟法、FAST法、CAST法、STOP法、紙片法、亮黑還原試驗(yàn)法、delvotest法、TTC法等[10]。

Okerman等[11]報(bào)道了用改進(jìn)歐洲四碟法檢測(cè)零售肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留，但檢測(cè)限高于歐盟所規(guī)定的最高殘留量（MRLs），只能檢測(cè)高濃度 FQs殘留，且不能準(zhǔn)確定性。Maki等[12]采用對(duì)蜂蜜中的7種FQs進(jìn)行殘留分析，檢測(cè)限（P/N>3）能達(dá)到2～9μg/kg；Nagel等[13]用3種抗生素高敏感型細(xì)菌（嗜熱脂肪土芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌），以微滴板法（半定量）準(zhǔn)確區(qū)分牛奶中包括氟喹諾酮類(lèi)的4類(lèi)抗生素殘留，將傳統(tǒng)培養(yǎng)皿法耗時(shí)24h縮短到6h；Kim等[14]運(yùn)用紙片法測(cè)定了97頭豬和83只雞體內(nèi)氟喹諾酮和四環(huán)素殘留，其中豬肉陽(yáng)性反應(yīng)率為39%，雞肉陽(yáng)性反應(yīng)率為13%；刑應(yīng)壽等[15]以藤黃微球菌為敏感菌，用杯碟法測(cè)定環(huán)丙沙星在雞肉組織中的殘留，此法對(duì)環(huán)丙沙星在磷酸緩沖液、肌肉、肝臟和腎臟中的檢測(cè)限分別為0.025、0.05、0.075μg/g；石穎[16]分離了青海弧菌Q67，以此為敏感菌檢測(cè)豬肉浸提液，結(jié)果顯示低濃度喹諾酮類(lèi)獸藥比磺胺類(lèi)和呋喃類(lèi)靈敏度高，最小檢出限為0.002mg/L。

2.2 免疫分析法 免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，其前處理簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、儀器要求條件低，但存在交叉反應(yīng)、無(wú)法準(zhǔn)確定量、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象等問(wèn)題，且免疫試劑的質(zhì)量差異大，使得該法不適合作殘留確證，適用于快速篩選。

由于FQs藥物分子量較小，不具備免疫原性，僅能以半抗原的形式與載體形成人工抗原，再以人工抗原免疫動(dòng)物制備抗體，在體外檢測(cè)中，研究應(yīng)用較多的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法、免疫膠體金法、免疫熒光法、免疫親和色譜、免疫傳感器等[17]。

Duan等[18]制備了環(huán)丙沙星多克隆抗體，建立了環(huán)丙沙星獸藥殘留的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)了豬肉、雞肉、牛乳中的環(huán)丙沙星殘留，檢測(cè)限為0.32ng/mL，加標(biāo)回收率分別為75.58%、81.2%、84.50%，多克隆抗體與恩諾沙星和諾氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為69.8%和44.6%。邢廣旭[19]在分析FQs類(lèi)藥物分子結(jié)構(gòu)和免疫原性基礎(chǔ)上，采用二環(huán)己碳二亞胺法將半抗原Nor（Nor結(jié)構(gòu)是FQs類(lèi)藥物的母核結(jié)構(gòu)）分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）進(jìn)行連接制備免疫抗原（Nor-BSA）和包被抗原（Nor-OVA），研制成功FQs藥物的ELISA多殘留檢測(cè)試劑盒和FQs藥物的mAb膠體金免疫試紙。結(jié)果表明，試劑盒的半抑制濃度（IC50）為4.61～6.27μg/L，試紙檢測(cè)50份豬肉陰性樣品的假陽(yáng)性率為0，檢測(cè)72份豬肉陽(yáng)性樣品假陰性率為0；不同批次的試紙批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%。

2.3 理化檢驗(yàn)法 FQs獸藥殘留檢測(cè)的微生物法和免疫分析往往只是用于初檢和快速檢驗(yàn)，不能準(zhǔn)確的定量，也不能用于定性的確證，在進(jìn)行準(zhǔn)確定量和定性確證的要求下，需要一些理化檢驗(yàn)手段，如高效液相色譜（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）、高效毛細(xì)管電泳（HPCE）、發(fā)光分析（CL）等。

2.3.1 色譜及聯(lián)用技術(shù) 在FQs獸藥殘留檢測(cè)中的色譜方法有薄層色譜法（TLC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、高效液相色譜（HPLC）、超高效液相色譜（UPLC）及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等，其中研究較多的為HPLC、UPLC和液質(zhì)聯(lián)用方法。HPLC、UPLC能夠進(jìn)行較為精確的定量，待測(cè)組分在色譜分離后可采用的檢測(cè)器有紫外、熒光和質(zhì)譜檢測(cè)器等，由于FQs類(lèi)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)具有熒光特性，所以較多采用熒光檢測(cè)器。HPLC、UPLC具有很高的分離復(fù)雜樣品基質(zhì)的能力，但是不能獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照來(lái)判斷目標(biāo)物是否存在，不是確證手段。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜（LC/MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）逐漸成為動(dòng)物源性食品中抗生素殘留分析的研究熱點(diǎn)，質(zhì)譜則可提高物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)信息，其具有高度選擇性以及強(qiáng)大的定性能力。

但色譜學(xué)方法的前處理過(guò)程較為復(fù)雜，目前獸藥殘留檢測(cè)的前處理技術(shù)研究較多的有固相萃?。⊿PE）[20]、固相微萃?。⊿PME）[21]、基質(zhì)固相分散（MSPD）[22]、分子印跡（MIT）[23]、磁性固相萃取（MSPE）[24]等前處理技術(shù)，這些前處理方法，存在成本高、回收率低等缺點(diǎn)；某些高端儀器如LC/MS/MS在日常檢測(cè)中也難以普及。

長(zhǎng)尾稔[25]等用HPLC（配熒光檢測(cè)器）同時(shí)測(cè)定豬肉、牛肉及雞肉中6種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的簡(jiǎn)化分析方法，回收率可達(dá)80%以上，檢出限范圍為0.002 5～0.05mg/kg。Moema等[26]檢測(cè)雞肝臟中的6種FQs獸藥殘留，樣本經(jīng)分散液-液微萃取凈化，用HPLC（配二極管陣列紫外檢測(cè)器）測(cè)定，在30～500μg/kg線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R為0.994 5～0.997 4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4%～7%，分別添加50、100、300μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品回收率范圍為83%～102%，檢出限LOD為5～19μg/kg。孫雷[27]等建立了檢測(cè)豬肉組織中7種氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。結(jié)果：7種FQs藥物在5～250ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997；方法檢測(cè)限為5ng/g，定量限為10ng/g；從10、20和100ng/g3個(gè)添加濃度檢測(cè)結(jié)果可以看出，方法平均回收率為80.7%～116%（n=6），批內(nèi)批間RSD均小于20%。郭偉等[28]采用固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立檢測(cè)雞肉中7種氟喳諾酮類(lèi)藥物殘留的確證分析方法，7種氟喳諾酮類(lèi)藥物在5～100μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99；以5、25、50μg/kg3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，樣品的平均回收率在79.2%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.9%，檢出限LOD為0.2～1.4μg/kg。祝曙華等[29]比較了4種商業(yè)固相萃取柱（SPE）在超高效液相色譜法（UPLC）檢測(cè)豬肉中4種氟喹諾酮類(lèi)藥物的應(yīng)用效果，結(jié)果顯示在10～100μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R大于0.999，檢出限為0.1～1.3μg/kg，定量限為0.1～4.2μg/kg，三種商品SPE柱均能用于豬肉中4種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)，而其中1種不能滿足檢測(cè)要求。

2.3.2 毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳法（CE），是以毛細(xì)管為分離通道、以直流電場(chǎng)為分離動(dòng)力，樣品中各組分在電場(chǎng)作用下遷移速率（淌度）不同，最終各組分先后通過(guò)檢測(cè)器被檢測(cè)。由于操作上常用高壓直流電場(chǎng)提高分離效率，又稱(chēng)高效毛細(xì)管電泳法（HPCE），其分離模式有毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等速電泳（CITP）、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）、毛細(xì)管電動(dòng)色譜（PICEC）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳（MGCC）、毛細(xì)管等電聚焦（ICE）等[30]。

毛細(xì)管電泳不受運(yùn)行緩沖液的酸堿性和其中的表面活性劑等的影響，具有試劑消耗少、分離模式多、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，加之近年來(lái)出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）技術(shù)，使得檢測(cè)的靈敏度大大提高，應(yīng)用前景更加廣泛。Gigosos等[31]采用HPCE檢測(cè)了牛的腎臟、肌肉和雞蛋等樣品中的環(huán)丙沙星、二氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、麻保沙星含量，檢測(cè)限分別為1.0、2.0、1.0、2.0、4.0μg/kg。汪雪雁等[32]等建立了HPCE法同時(shí)檢測(cè)雞肝中3種FQs藥物和2種磺胺類(lèi)藥物殘留，5種抗生素在給定條件下10min內(nèi)完成分離，平均回收率在85.39%～90.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.95%～3.41%，相關(guān)系數(shù)R為0.996 9～0.998 5，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.3 發(fā)光分析法 FQs的發(fā)光分析基于氟喹諾酮藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，通過(guò)反應(yīng)使得FQs分子發(fā)光或者增敏其他發(fā)光分子，再通過(guò)發(fā)光的光譜強(qiáng)度測(cè)定來(lái)對(duì)FQs定量，分為化學(xué)發(fā)光分析法（CL）和電化學(xué)發(fā)光分析法（ECL）兩類(lèi)[33]。

化學(xué)發(fā)光分析法和電化學(xué)發(fā)光法設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、檢測(cè)靈敏度高，但都存在對(duì)不同種類(lèi)的氟喹諾酮藥物的分析選擇性較差的缺點(diǎn)。Schneider等[34]利用FQs和Tb3+復(fù)合對(duì)DNA發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)作用對(duì)牛血清樣品中恩諾沙星藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，在25、50和100ng/mL加標(biāo)濃度上平均回收率為73.88%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為11%，最低檢測(cè)限為2.5ng/mL，未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。Yao等[35]發(fā)現(xiàn)了氟喹諾酮類(lèi)藥物和過(guò)硫酸共同存在下，電位掃描可產(chǎn)生非常強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，解釋了電化學(xué)發(fā)光機(jī)理，為建立快速、靈敏的FQs電化學(xué)發(fā)光分析提供了新的路徑。Zhou等[36]通過(guò)毛細(xì)管電泳技術(shù)與FQs增敏聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用，建立了新的FQs檢測(cè)方法，對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測(cè)限分別為15ng/mL和10ng/mL。

3 結(jié)語(yǔ)

本文綜述了微生物法、免疫分析法和理化檢驗(yàn)法這三大類(lèi)FQs獸藥殘留檢測(cè)方法，分析了各類(lèi)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)FQs獸藥殘留檢測(cè)篩選、定量、確證等目的，選擇合適的分析方法。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，動(dòng)物源性食品消費(fèi)量也在迅速增加，F(xiàn)Qs類(lèi)抗生素在動(dòng)物源性食品生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，殘留也較為嚴(yán)重，存在著重大的食品安全隱患。隨著食品安全意識(shí)的提高，對(duì)獸藥殘留的防控意識(shí)也在不斷的增強(qiáng)。目前，各國(guó)科技工作者對(duì)于FQs殘留檢測(cè)進(jìn)行了大量的研究工作，一些新技術(shù)、新方法正積極嘗試在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，如：QuEChERS方法[37]、分子印跡（MIT）、超臨界流體萃?。⊿FE）等前處理方法，以及免疫傳感器、生物芯片等檢測(cè)技術(shù)，尤其各類(lèi)前處理技術(shù)的創(chuàng)新和深入，必將推動(dòng)FQs獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的方向朝著快速、廉價(jià)、準(zhǔn)確的方向不斷邁進(jìn)。

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