漆酶的研究進展及其應(yīng)用

劉巖 劉銳 蘇新國 趙冠里 楊昭

摘 要：漆酶是一種多酚氧化酶，由于其在自然界分布廣泛，并且在環(huán)保、紡織、印染、食品、化學(xué)合成等方面都具有廣泛的應(yīng)用前景，近年來得到了廣泛的關(guān)注和研究。該文主要綜述了國內(nèi)外漆酶的研究進展及其應(yīng)用，為細菌漆酶提供新的應(yīng)用前景和方向。

關(guān)鍵詞：漆酶；研究進展；應(yīng)用

中圖分類號 Q814 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）13-0025-04

1 引言

漆酶（EC 1.10.3.2）又名藍色多銅氧化酶，可以氧化包括酚類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、苯胺、木質(zhì)素、多環(huán)芳香烴甚至無機物等一系列物質(zhì)，以分子氧氣為電子受體，生成反應(yīng)過程中唯一的副產(chǎn)物水。因此，其在有毒廢水處理、染料脫色、紡織、造紙、酒及飲料、生物傳感器、抗癌藥物及化妝品合成等方面都具有廣泛的應(yīng)用前景，從而受到了科學(xué)界的重視。當(dāng)前應(yīng)用最多的是真菌漆酶，但由于真菌漆酶不耐高溫，在堿性條件下迅速失活，存在多種抑制劑，嚴(yán)重限制了其工業(yè)化應(yīng)用。真菌漆酶一般為含有糖基的糖蛋白，形成了基因工程改造及異源表達上的障礙。細菌漆酶一般為單體蛋白，且具有耐高溫，在堿性條件下穩(wěn)定，抑制劑少等優(yōu)點，可以克服真菌漆酶應(yīng)用的缺點，具有巨大的應(yīng)用潛力。

2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及進展

漆酶為藍色多銅氧化酶中最大的一類，具有通過銅粒子將多酚物質(zhì)氧化，同時將氧氣還原成水的催化特性[1]。早在1883年，Yoshida第一次在日本漆樹中發(fā)現(xiàn)了漆酶，成為世界上最早的被發(fā)現(xiàn)的酶類之一[2]。植物漆酶由于缺少工業(yè)應(yīng)用價值，而長期被忽視。在現(xiàn)代工業(yè)廢水中去除多酚類有毒物質(zhì)，在紡織印染中去除木質(zhì)素、色素等生物技術(shù)的不斷研發(fā)中，由于漆酶具有利用氧氣作為電子受體，能夠氧化多酚類、木質(zhì)素等多種化學(xué)物質(zhì)，同時生成唯一的副產(chǎn)物水，這些自身具備的優(yōu)質(zhì)條件使得漆酶的催化性質(zhì)在環(huán)保、紡織、印染、食品、化學(xué)合成方面具有廣泛的應(yīng)用前景，成為最近10年科學(xué)界最關(guān)注的焦點之一[3]。新型漆酶的研發(fā)，漆酶空間結(jié)構(gòu)及其催化機理，酶學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用等成為科學(xué)研究的熱點。我國的研究人員也逐漸認識到漆酶在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢，近些年研究勢頭迅猛[4-10]。

2.1 漆酶在自然界的分布 漆酶在自然界中廣泛分布。第一種漆酶是由日本人Yoshida在1883年在植物漆樹（Rhus vernicifera）樹脂中發(fā)現(xiàn)的，隨后在多種植物如楊樹[11]、煙草[12]等中均有發(fā)現(xiàn)。在多種真菌中均檢測到真菌漆酶的活性，到2008年經(jīng)學(xué)者統(tǒng)計已經(jīng)超過百種真菌漆酶被分離提純[13]，而這個數(shù)字還在快速的增加[14-16]。長期以來，人們一直以為漆酶僅僅存在于真核生物，直到1993年Givaudan首先在水稻根圍土壤中分離得到一株產(chǎn)漆酶的脂固氮螺菌[17]，這是第一次在原核生物中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)漆酶菌株。2000年Alexandre通過生物信息學(xué)技術(shù)，證實漆酶也普遍存在于原核生物中[18]。迄今為止，已經(jīng)分離提純的細菌漆酶有海洋微生物Marinomonas mediterranea產(chǎn)生的多酚氧化酶PPQ[19]，假單胞菌屬的CopA蛋白[20]，鏈霉菌屬的類漆酶EpoA[21]，枯草芽孢桿菌中芽孢外被上面含有CotA蛋白[22]等。而產(chǎn)漆酶細菌也在不斷的被發(fā)現(xiàn)，如2009年Telke在印度染織廠廢水流經(jīng)的土壤中篩選出產(chǎn)漆酶的假單胞菌LBC1[23]，2009年在突尼斯城市土壤中篩選得到產(chǎn)漆酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌AAP56[24]，2010年Wang等在黑龍江森立的土壤中分離得到產(chǎn)漆酶的枯草芽孢桿菌WD23菌株[25]。但是相對真菌漆酶，關(guān)于細菌漆酶的研究還是非常少的。

2.2 漆酶的性質(zhì) 通過對真菌漆酶X晶體衍射，分析其空間結(jié)構(gòu)與催化機理，可知漆酶每個催化單位結(jié)合有四個銅粒子，根據(jù)其電子順磁共振光譜，將四個銅粒子分成三種類型，第一種類型（T1）銅粒子賦予蛋白藍色，并在610nm處具有吸收峰，第二類型（T2）銅粒子與一對第三類型的（T3）銅粒子形成一個三角環(huán)區(qū)（trinuclear cluster TNC）[26]。在催化反應(yīng)過程中，T1銅粒子在反應(yīng)底物中依次接受四個電子，通過His–Cys–His三肽將電子傳遞給TNC，氧氣在TNC處被還原成水。其中T1銅粒子的氧化還原電位決定了漆酶的催化效率[27]。漆酶利用氧氣作為電子受體，將酚式羥基轉(zhuǎn)化成為自由基引發(fā)一些反應(yīng)，進而導(dǎo)致烷基鏈上C-C和C-O鍵和芳香環(huán)鍵的斷裂[28]。漆酶的氧化還原電位一般≤0.8V，而非酚化合物的氧化還原電勢大約在1.3V左右，所以此類物質(zhì)不能被漆酶直接氧化[29]。對于這類氧化還原電勢高于漆酶的化合物，或者由于分子空間結(jié)構(gòu)較大不能直接接觸漆酶活性中心的大分子物質(zhì)，可以通過添加化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)作為電子穿梭機（electron shuttles）進而協(xié)助漆酶完成催化反應(yīng)。真菌漆酶獨自或者在添加化學(xué)介導(dǎo)物的條件可以利用氧氣為電子受體，氧化酚類、多酚類、苯胺、木質(zhì)素、多環(huán)芳香烴甚至無機物等一系列物質(zhì)，同時將氧氣轉(zhuǎn)變成為水。酶促反應(yīng)需要空氣中的氧氣，而唯一的副產(chǎn)物為水。與需要添加Mn+2木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和添加藜蘆基醇錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）相比，具有巨大優(yōu)勢。

2.3 漆酶-介導(dǎo)反應(yīng)體系（LMS）和化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì) 1990年，Bourbonnais首先報道了在添加2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）的情況下，可以利用漆酶氧化非酚木質(zhì)素模型分子[30]，這一發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致LMS體系的建立。LMS體系極大地擴大了漆酶的作用范圍，從此以后，科學(xué)界在研究LMS體系反應(yīng)機理，尋找化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)作了大量的研究工作。化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)可以分為合成物質(zhì)和天然物質(zhì)兩種，常用的合成化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)有ABTS、1-羥基苯并三唑（HBT）、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺（HPI）等[29]。為了克服合成的化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)價格昂貴、具有毒性等缺點，學(xué)者同時致力開發(fā)天然的化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)。朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）的一種次級代謝產(chǎn)物3-Hydroxyanthranilic acid是報道的第一種天然介導(dǎo)物質(zhì)[31]。2005年Camarero創(chuàng)建了活性黑5為漆酶作用底物，檢測吸光度變化篩選天然化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)的篩選方法，并得了到10種天然酚類介導(dǎo)物質(zhì)[32]。到2008年，已有將近100多中化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)[12]。但是上述LMS體系建立往往都是針對真菌漆酶，關(guān)于細菌漆酶的LMS體系的研究還鮮有報道。

2.4 漆酶的應(yīng)用

2.4.1 在處理頑固污染方面的應(yīng)用 石油精煉、造紙廠、化工廠、農(nóng)藥廠、鑄造廠和印染廠中產(chǎn)生的廢水經(jīng)常含有大量的酚類、多環(huán)芳香等有毒有色難降解物質(zhì)，去除這些難降解有毒大分子物質(zhì)一直是污水處理工程中的一個難題。漆酶單獨或者建立LMS體系，可以將此類生物難降解物質(zhì)氧化，轉(zhuǎn)變成無色，無毒可生物降解物質(zhì)。2002年，Tsioulpas利用多種可產(chǎn)漆酶菌株降解橄欖油廠中含有酚類化合物廢水，其中酚類物質(zhì)可以去除69%～76%，同時廢水顏色有黑色轉(zhuǎn)變成透明的淺黃色。2005年，Ryan報道了利用白腐霉（CBS 696.94）去除廢水中酚類物質(zhì)，可以達到每1d每1g生物量降解0.033g酚類物質(zhì)。2010年Wang利用自己篩選的產(chǎn)細菌漆酶WD23將雷馬素艷藍R、茜素紅、干果紅、甲基橙、甲基紫等染料降解50%～90%。

2.4.2 在其它方面的應(yīng)用 在造紙工業(yè)中，可采用漆酶LMS系統(tǒng)對紙漿進行漂白并去除木質(zhì)素[33-34]，來取代傳統(tǒng)的對環(huán)境會造成重大污染的氯化物漂白工藝。在紡織工業(yè)中，除去利用漆酶降解其中含染料廢水外，還可以利用漆酶進行布料漂白[35]。1996年Novozyme公司開發(fā)了第一款在用于牛仔褲仿舊處理的漆酶產(chǎn)品DeniLit。2001年Zytex公司開發(fā)了降解靛藍的漆酶商品Zylite。在食品方面，漆酶可以通過選擇性去除食品多酚類物質(zhì)，進而提高其產(chǎn)品風(fēng)味口感，降低成本等[36]。漆酶在化學(xué)合成，木質(zhì)素降解生產(chǎn)生物能源，生物傳感器等方面也具有廣泛的應(yīng)用[37]。

3 前景與展望

利用微生物酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)被稱之為生物技術(shù)或者綠色化學(xué)，是歐洲倡導(dǎo)的生物經(jīng)濟的主要領(lǐng)域之一。而能在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的酶類，必須具備一定的抗高溫，耐強堿，抵抗剪切力，在一定的儲存期間不會失活等優(yōu)良性質(zhì)[38]。真菌漆酶的使用范圍為pH4～6，溫度30～50℃[38]，且多種物質(zhì)敏感，氯化物、疊氮化合物、氫氧化物等均可以抑制真菌漆酶的活性[39]。為了改善漆酶性質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，利用基因工程進行異源表達是行之有效的方法。但是由于真菌漆酶為糖蛋白，且其糖基對漆酶的特性及其活性具有重要影響，因此真菌漆酶在異源表達上困難重重[40]，直到現(xiàn)在還沒有真菌漆酶在大腸桿菌中表達成功的報道[39，40]。

細菌漆酶能彌補真菌漆酶所具有的缺點，其一般不具有糖蛋白，易于進行異源表達，進行基因改造和大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。細菌漆酶一般最適作用pH為堿性環(huán)境，耐高溫，對抑制劑不敏感。如Wang報道的枯草芽孢桿菌WD23產(chǎn)生的漆酶在80℃下半衰期為2.5h，pH為9的條件下半衰期為15d[25]。芽孢桿菌C-125得到一種漆酶，其最適作用pH為7.5～8，氯化物對其不但沒有抑制作用反而可以刺激提高酶活[41]。細菌漆酶展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。但是現(xiàn)在關(guān)于細菌漆酶的研究太少，嚴(yán)重阻礙了細菌漆酶的應(yīng)用[26，38，40]。因此，開展對細菌漆酶的廣泛研究具有重要的意義。

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