以六倍體（AnAnCnCnCoCo）為橋梁創(chuàng)制抗旱新型甘藍(lán)型油菜（AnArCnCo）

萬(wàn)華方，魏帥，馮宇霞，錢(qián)偉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，重慶 400716）

0 引言

【研究意義】甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，2n=38，AACC）大約起源于 7 500年前，是由白菜型油菜（Brassica rapa，2n=20，AA）和甘藍(lán)（Brassica oleracea，2n=18，CC）雜交，并自然加倍形成的異源四倍體物種[1-2]，是溫帶地區(qū)第二重要的油料作物[3]。干旱嚴(yán)重影響作物（包括油菜）的生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[4]。隨著菜籽油需求量的不斷上升，油菜產(chǎn)業(yè)受到干旱的威脅日益嚴(yán)重[5]，僅中國(guó)長(zhǎng)江流域的油菜受秋旱影響就可減產(chǎn)20%左右[6]。因此，改良甘藍(lán)型油菜的抗旱性是一個(gè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。然而，有限的原始親本生態(tài)型、暫無(wú)其野生群體，以及“雙低”品質(zhì)選育過(guò)程引起的種質(zhì)資源遺失，致甘藍(lán)型油菜遺傳背景狹窄[2,7-9]，進(jìn)而限制了甘藍(lán)型油菜的抗旱育種研究[10]。利用其祖先種向甘藍(lán)型油菜導(dǎo)入外源遺傳成分是拓展其遺傳背景的有效途徑[11-15]。白菜型油菜 A基因組的遺傳滲入有利于拓展甘藍(lán)型油菜的遺傳背景[16]。白菜型油菜的農(nóng)藝性狀變異豐富[17-19]，并具有耐遲播、生育期短、耐貧瘠、耐干旱等突出優(yōu)點(diǎn)[20]，是甘藍(lán)型油菜遺傳改良的重要資源[11,21-23]。因此，進(jìn)行白菜型油菜抗旱性資源的鑒定，并以其為親本合成具有優(yōu)良抗旱性的新型甘藍(lán)型油菜，對(duì)于提高油菜抗旱性能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用親本物種豐富的遺傳變異拓寬遺傳背景是改良現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜的一個(gè)重要方法[24]。RIPLEY等[25]利用甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜雜交，成功將甘藍(lán)的自交不親和性導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜。岳芳等[26]以六倍體（ArArAnAnCnCn）與甘藍(lán)種間雜交，合成了新型甘藍(lán)型油菜。錢(qián)偉等[27]以甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)為親本，創(chuàng)建了六倍體（AnAnCnCnCoCo），并以其為橋梁，利用白菜型油菜豐富的遺傳資源拓寬了現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜的遺傳背景。MEI等[28]以六倍體（AnAnCnCnCoCo）作為橋梁，與甘藍(lán)型油菜不斷回交，獲得了轉(zhuǎn)移野生甘藍(lán)菌核病抗性的新型甘藍(lán)型油菜。李勤菲等[29]以六倍體（AnAnCnCnCoCo）為橋梁，將甘藍(lán)型油菜親本種的優(yōu)良性狀導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜中?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘藍(lán)型油菜相對(duì)狹窄的遺傳背景限制了其抗旱育種。耐干旱的白菜型油菜是重要的抗旱資源，但以其與甘藍(lán)型油菜雜交、自交或回交選育新型甘藍(lán)型油菜所需的周期長(zhǎng)，效率低[29]。六倍體是拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳背景的新材料[27-29]，但以其為橋梁，轉(zhuǎn)移白菜型油菜優(yōu)良抗旱性的研究鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)PEG-6000溶液模擬干旱，評(píng)價(jià)白菜型油菜的抗旱性，并以六倍體材料為橋梁，以抗旱的白菜型油菜為抗性父本，創(chuàng)建具有優(yōu)良抗旱性的新型甘藍(lán)型油菜，為甘藍(lán)型油菜抗旱育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以11份六倍體作為母本（電子附表1）、68份白菜型油菜（電子附表 2）作為父本，創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜。

9份白菜型油菜、9份新型甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)型油菜中雙11號(hào)（抗旱性好，種植廣泛）為抗旱性分析材料（電子附表3），以中雙11號(hào)為對(duì)照。

1.2 PEG-6000模擬干旱

參照SHANGGUAN 等[30]方法，設(shè) 0（CK）、100、150、200、250和300 g·L-16個(gè)PEG-6000質(zhì)量濃度，對(duì)不同的 9份白菜型油菜在萌發(fā)期進(jìn)行模擬干旱處理；設(shè) 0（CK）、100、150、200、250、300、350、400和600 g·L-1PEG-6000質(zhì)量濃度，對(duì)9份新型甘藍(lán)型油菜和中雙11號(hào)在萌發(fā)期進(jìn)行模擬干旱處理。分別篩選用于白菜型油菜和甘藍(lán)型油菜抗旱性鑒定的PEG-6000最適濃度。

取直徑9 cm的培養(yǎng)皿，鋪墊雙層濾紙，并以相應(yīng)濃度的PEG-6000溶液5 mL浸潤(rùn)濾紙；取種子30粒均勻放置于上述浸潤(rùn)過(guò)的濾紙上，并蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于組培室（25℃黑暗8 h/27℃光照16 h）培養(yǎng)，每天定時(shí)向培養(yǎng)皿中加入對(duì)應(yīng)濃度的1 mL PEG-6000溶液，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)。以清水浸泡濾紙為對(duì)照。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

參照陳郡雯等[31]方法進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。每天定時(shí)觀(guān)察種子萌發(fā)的粒數(shù)，測(cè)量胚根部位長(zhǎng)度，以其為種子直徑的一半為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。按照萌發(fā)的基本情況，以第 3天的種子萌發(fā)數(shù)值計(jì)算萌發(fā)勢(shì)和相對(duì)萌發(fā)勢(shì)，以第8天的發(fā)芽數(shù)值計(jì)算萌發(fā)率和相對(duì)萌發(fā)率，并且在第8天隨機(jī)選出10株，計(jì)算其相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)胚軸長(zhǎng)。

種子萌發(fā)抗旱指數(shù)（drought resistance index，DRI）=水分脅迫下種子萌發(fā)指數(shù)（plumule index of stress，PIS）/對(duì)照種子萌發(fā)指數(shù)（plumule index of control，PIC）；萌發(fā)指數(shù)（plumule index，PI）=1nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8（nd2、nd4、nd6、nd8 相對(duì)應(yīng)的是當(dāng)天的種子萌發(fā)率），包括PIS和PIC類(lèi)型；

萌發(fā)率（germination rate，GR）=正常萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子的總數(shù)×100%；

相對(duì)萌發(fā)率（relaltive germination rate，RGR）=（處理萌發(fā)率/對(duì)照萌發(fā)率）×100%；

萌發(fā)勢(shì)（sprout potential，SP）=達(dá)到高峰（第 3天萌發(fā)的種子數(shù)）時(shí)正常萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子的總數(shù)；

相對(duì)萌發(fā)勢(shì)（relative sprout potential，RSP）=（處理萌發(fā)勢(shì)/對(duì)照萌發(fā)勢(shì)）×100%；

相對(duì)根長(zhǎng)（relative root length，RRL）=（處理根長(zhǎng)/對(duì)照根長(zhǎng)）×100%；

相對(duì)胚軸長(zhǎng)（relative stem length，RSL）=（處理胚軸長(zhǎng)/對(duì)照胚軸長(zhǎng)）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SAS v8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。參照陳郡雯等[31]方法進(jìn)行綜合隸屬函數(shù)值法分析，公式為R(Xi)=(Xi—Xmin)/(Xmax—Xmin)。反函數(shù)隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為R(Xi)=1—(Xi—Xmin)/(Xmax—Xmin)，式中Xi指試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Xmax、Xmin表示的是所對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的最大值和最小值。

2 結(jié)果

2.1 新型甘藍(lán)型油菜的鑒定

以11份六倍體與68份白菜型油菜雜交，獲得124份新型甘藍(lán)型油菜。在苗期（圖1-Ⅰ、圖1-Ⅱ和圖1-Ⅲ），新型甘藍(lán)型油菜的表型介于兩親本之間。體細(xì)胞觀(guān)察結(jié)果表明，所利用的六倍體的體細(xì)胞染色體數(shù)目為56（圖1-Ⅳ），而合成的新型甘藍(lán)型油菜的體細(xì)胞染色體數(shù)目為38（圖1-Ⅴ）?；ǚ塾越Y(jié)果表明，六倍體的花粉育性約90%（圖1-Ⅵ），新型甘藍(lán)型油菜的花粉育性約80%（圖1-Ⅶ）。在苗期，隨機(jī)選擇59份長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的新型甘藍(lán)型油菜、7份六倍體、10份白菜型油菜以及20份自然甘藍(lán)型油菜提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，并進(jìn)行主成分分析。第一、第二和第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為13.92%、11.59%和9.09%。主成分分析將所有的供試材料分成3類(lèi)（圖1-Ⅷ），即白菜型油菜、六倍體、甘藍(lán)型油菜（包括新型甘藍(lán)型油菜和自然甘藍(lán)型油菜），但新型甘藍(lán)型油菜與自然甘藍(lán)型油菜明顯分開(kāi)，表明以六倍體為橋梁創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜切實(shí)可行。

2.2 篩選合適的PEG-6000濃度

依據(jù)染色體數(shù)目、花粉育性，從59份新型甘藍(lán)型油菜中選取9份進(jìn)行模擬抗旱研究（圖2），在不同濃度 PEG-6000溶液的處理下，油菜種子萌發(fā)均受到不同程度的抑制，并且隨著濃度梯度增加，平均根長(zhǎng)隨之降低。當(dāng)PEG-6000濃度達(dá)到250 g·L-1時(shí)，9份新型甘藍(lán)型油菜與中雙 11號(hào)的平均根長(zhǎng)為對(duì)照的40.2%（圖 2-Ⅰ），根長(zhǎng)相對(duì)值變異系數(shù)最大，表明不同材料的平均根長(zhǎng)有顯著性差異，250 g·L-1的處理濃度為新型甘藍(lán)型油菜模擬干旱的最適處理濃度（圖2-Ⅱ）。當(dāng)PEG-6000濃度達(dá)到200 g·L-1時(shí)，白菜型油菜的平均根長(zhǎng)為對(duì)照的30.4%（圖2-Ⅲ），白菜型油菜根長(zhǎng)相對(duì)值變異系數(shù)最大，表明不同材料的平均根長(zhǎng)有顯著性差異，200 g·L-1的處理濃度為白菜型油菜模擬干旱的最適處理濃度（圖2-Ⅳ）。

圖1 新型甘藍(lán)型油菜的鑒定Fig.1 Identification of new-type B.napus

圖2 油菜在不同濃度PEG-6000條件下根長(zhǎng)的變化Fig.2 Root length of rapeseed treated by PEG-6000 solution with different concentration

2.3 油菜萌發(fā)期抗旱性相關(guān)指標(biāo)測(cè)定及主成分分析

使用250 g·L-1的PEG-6000溶液對(duì)新型甘藍(lán)型油菜和中雙11號(hào)進(jìn)行處理，用200 g·L-1的PEG-6000溶液對(duì)白菜型油菜進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)相對(duì)萌發(fā)勢(shì)、相對(duì)萌發(fā)率、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)胚軸長(zhǎng)以及萌發(fā)抗旱指數(shù)，構(gòu)成主成分分析的原始矩陣（表1）。

使用250 g·L-1的PEG-6000溶液對(duì)新型甘藍(lán)型油菜進(jìn)行模擬干旱處理，選用5個(gè)指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行主成分分析（表 2），第一、第二、第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為48.62%、35.47%和11.93%。以200 g·L-1的PEG-6000溶液對(duì)白菜型油菜進(jìn)行模擬干旱處理，對(duì)5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。第一、第二、第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為71.61%、19.01%和6.43%。由此可見(jiàn)，第一、第二和第三主成分所包含的信息集中反映了甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜萌發(fā)期抗旱性的各項(xiàng)指標(biāo)在干旱脅迫環(huán)境下的相互關(guān)系，由此建立起來(lái)的評(píng)價(jià)體系可用于甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜萌發(fā)期的抗旱能力評(píng)價(jià)。

2.4 油菜萌發(fā)期抗旱性隸屬函數(shù)分析

運(yùn)用綜合隸屬函數(shù)法對(duì)新型甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜萌發(fā)期模擬抗旱檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分析，并以5個(gè)抗旱指標(biāo)的平均值為指標(biāo)評(píng)價(jià)抗旱性（表 3）。結(jié)果表明，白菜型油菜8M664、8M655、8M693相比其他白菜型油菜，均具有更好的抗旱性。新型甘藍(lán)型油菜9X018、9X015、9X016的抗旱性?xún)?yōu)于中雙11號(hào)，9X111的抗旱性基本與中雙11號(hào)持平，其他供試材料的抗旱性均低于中雙11號(hào)。

通過(guò)對(duì)新型甘藍(lán)型油菜 9X111、9X016、9X015和 9X018及其父本白菜型油菜 8M693、8M664、8M655和8M664的隸屬函數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析（表4），發(fā)現(xiàn)9X111與其父本8M693呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.672），9X016與其父本8M664呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r=0.864，P＜0.05），9X015與其父本 8M655呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.372），9X018與其父本 8M664呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r=0.991，P＜0.01）。結(jié)果表明，以六倍體為橋梁，可將白菜型油菜的優(yōu)良抗旱性導(dǎo)入新型甘藍(lán)型油菜，進(jìn)而獲得抗旱性提高的甘藍(lán)型油菜。

表1 油菜萌發(fā)期抗旱性相關(guān)指標(biāo)主成分分析原始矩陣Table 1 Primitive matrix of principal component analysis on drought-resistance indices of rapeseed at germination stage

表2 模擬干旱相關(guān)指標(biāo)的主成分分析Table 2 Principal component analysis on drought-resistance-related indicators on rapeseed

表3 模擬干旱相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 3 Membership function value of drought-resistance-related indicators of rapeseed under simulated drought stress

表4 模擬干旱隸屬函數(shù)值的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of simulated drought membership function values

3 討論

甘藍(lán)型油菜是由甘藍(lán)和白菜型油菜雜交，經(jīng)自然加倍而成。由于其栽培歷史短，相對(duì)于其親本種而言，甘藍(lán)型油菜遺傳背景較為狹窄[1]。利用甘藍(lán)型油菜親本種豐富的遺傳變異擴(kuò)展其遺傳背景已有不少報(bào)道。甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交后不斷自交，合成的甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性更豐富[32]。QUAZI等[33]利用甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜雜交，成功將羽衣甘藍(lán)的蚜蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜；DING等[34]通過(guò)人工合成甘藍(lán)型油菜的途徑，將甘藍(lán)親本的菌核病抗性導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜。甘藍(lán)型油菜另一祖先種—白菜型油菜分別獨(dú)立起源于歐洲和亞洲，具有豐富的遺傳變異[18]，具備耐貧瘠、耐干旱、抗寒性強(qiáng)、生育期短等特性，為甘藍(lán)型油菜遺傳改良提供了豐富的遺傳資源[20]。甘藍(lán)型油菜A亞基因組比C亞基因組變異更豐富，白菜型油菜A亞基因組成分對(duì)于甘藍(lán)型油菜的遺傳變異有很大的影響，其遺傳滲入有利于改變甘藍(lán)型油菜遺傳背景[16]。利用白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜的策略已在甘藍(lán)型油菜育種中得到應(yīng)用[35]，但此策略中仍需要進(jìn)行胚挽救，且從后代中選擇獲得甘藍(lán)型油菜的周期長(zhǎng)，效率低。因此，利用其他策略轉(zhuǎn)移白菜型油菜的優(yōu)良性狀到甘藍(lán)型油菜具有重要意義。XIAO等[35]利用埃塞俄比亞芥（B.carinata，BBCC，2n=34）與白菜型油菜雜交，經(jīng)染色體加倍獲得六倍體AABBCC，再與甘藍(lán)型油菜雜交獲得五倍體AABCC，而后進(jìn)行自交，可獲得新型甘藍(lán)型油菜。近些年，許多研究者提出了利用六倍體為橋梁改良甘藍(lán)型油菜的方法。錢(qián)偉等[27]發(fā)明了一種以甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交創(chuàng)建六倍體AnAnCnCnCoCo的方法，并以此六倍體材料為橋梁與大量白菜型油菜雜交，同時(shí)導(dǎo)入甘藍(lán)和白菜型油菜的遺傳成分，有效拓寬了現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜的遺傳背景。隨后有許多的研究者運(yùn)用此方法，以六倍體材料為橋梁合成新型甘藍(lán)型油菜。MEI等[28]、劉瑤等[36]利用抗菌核病的甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜雜交獲得六倍體，利用此六倍體與甘藍(lán)型油菜回交，創(chuàng)建了菌核病抗性改良的新型甘藍(lán)型油菜。以此六倍體與白菜型油菜雜交，進(jìn)一步拓寬了甘藍(lán)型油菜遺傳背景，且獲得了具有菌核病抗性、含白菜型油菜遺傳成分的新型甘藍(lán)型油菜[29]。本研究利用的六倍體材料（AnAnCnCnCoCo），前期導(dǎo)入了甘藍(lán)的遺傳成分，有效增加了遺傳多樣性，且以此六倍體與具備優(yōu)良抗旱性的白菜型油菜（ArAr）雜交，可以快速獲得新型甘藍(lán)型油菜AnArCnCo，避免了不斷地自交或者回交過(guò)程，最大程度快速拓寬了甘藍(lán)型油菜的抗旱性遺傳背景，為甘藍(lán)型油菜抗旱性育種提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。

植物的抗旱性是由多個(gè)基因決定的遺傳性狀，受基因型和水分脅迫的雙重制約[37-39]。盧坤等[40]以RNA-Seq技術(shù)在甘藍(lán)型油菜葉片中鑒定了部分干旱脅迫應(yīng)答基因。CHEN等[41]對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的甘藍(lán)型油菜葉和根進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)分別有582個(gè)和438個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫響應(yīng)中受到差異調(diào)節(jié)。ZHANG等[42]鑒定了79個(gè)在甘藍(lán)型油菜水分脅迫耐受中起作用的候選基因，其中8個(gè)基因與干旱耐受性相關(guān)。本研究將白菜的抗旱性進(jìn)行了有效轉(zhuǎn)移，創(chuàng)建了抗旱性新型甘藍(lán)型油菜，可為甘藍(lán)型油菜抗旱性育種提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，但是對(duì)其分子基礎(chǔ)仍不清楚，因此還有待更深入的研究。后續(xù)研究中，不僅要深入挖掘白菜型油菜產(chǎn)生抗旱性產(chǎn)生的關(guān)鍵基因，還要深入探討白菜型油菜A亞基因組的導(dǎo)入對(duì)于甘藍(lán)型油菜基因組結(jié)構(gòu)、基因組表達(dá)特性產(chǎn)生的深遠(yuǎn)影響。

4 結(jié)論

以六倍體材料為橋梁，與抗旱的白菜型油菜雜交，創(chuàng)制、篩選獲得了具有優(yōu)良抗旱性的新型甘藍(lán)型油菜，可為甘藍(lán)型油菜抗旱育種提供優(yōu)良的基因資源。