艾納香油對曬傷小鼠皮膚氧化應(yīng)激及DNA損傷的影響

李小婷 王丹 龐玉新 楊全 范佐旺 馬青松 許羅鳳

摘 要 觀察艾納香油對UVB照射后Blab/C小鼠曬傷皮膚氧化應(yīng)激及DNA損傷的影響。通過建立4組小鼠曬傷模型，在5個不同時間相點測定小鼠皮膚曬傷組織厚度和含水量，利用可見光分光光度法測各組皮膚組織中超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量。結(jié)果表明：艾納香油可明顯加快曬傷創(chuàng)面處結(jié)痂脫落，抑制曬傷皮膚組織增厚（P<0.05），減少曬傷組織皮膚含水量的喪失（P<0.05，P<0.01）；在整個治療過程，能明顯提高小鼠血清SOD活性（P<0.05，P<0.01），降低皮膚MDA含量（P<0.05），升高皮膚GSH的水平（P<0.05），降低皮膚8-OHdG含量（P<0.01）。艾納香油可抵抗UVB曬傷后小鼠表皮增厚，減少光產(chǎn)物表達，并通過清除氧自由基，提高抗氧化酶活性而發(fā)揮抗氧化作用。

關(guān)鍵詞 艾納香油 ；中波紫外線 ；抗氧化

分類號 R284.1 ；S567.23+9 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.012

Effects of Blumea Balsamifera Oil on Oxidative Stree

and DNA Damages in a Model of Skin Sunburn in Mice

LI Xiaoting1，2，3） WANG Dan2，3） PANG Yuxin22，3）

YANG Quan1） FAN Zuowang1，2，3） MA Qingsong1，2，3） XU Luofeng1，2，3）

（1 School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University，

Guangzhou， Guangdong 510006， China；

2 Tropical crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China；

3 Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera，

Danzhou， Hainan 571737， China）

Abstract To evaluate the protective effect of Blumea balsamifera oil on UVB irradiation-induced skin sunburn in Blab/C mice. The sunburn mouse models were established by UVB irradiation. The mice were randomly divided into four groups. The skin erythema and edema were assessed. The thickness of epidermis and the water content of tissues were determined and the levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA），glutathione （GSH）， 8-Hydroxy-desoxyguanosine in its epidermis were measured with visible spectrophotometry methods at 5 different time points. Results： The skin loss of Blumea balsamifera oil group was accelerated. The topical application of Blumea balsamifera oil resulted in a significant decreasing in UVB-induced increases in skin thickness. Further more， Blumea balsamifera oil treatments also resulted in a significant increasing the level of SOD and GSH， decreasing the loss of skin water content and MDA， especially depressing in UVB mediated generation of 8-OHdG. We suggest that Blumea balsamifera oil could be developed as an agent for the management of condition selicited by UV exposure including skin sunburn.

Keywords Blumea balsamifera oil ； ultraviolet B irradiation ； antioxidant

醫(yī)學研究表明，曬傷是由于皮膚接受了超過耐受量的UVB而引起的光毒反應(yīng)[1]。曬傷發(fā)生機制之一是產(chǎn)生高度反應(yīng)活性的活性氧族與各種細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用而造成皮膚曬紅和曬傷，引起DNA的直接改變和損傷，誘發(fā)炎癥甚至是皮膚癌，嚴重影響人們的健康[2]。多項研究表明，UVB輻射引起皮膚細胞DNA損傷標志物主要為8-OHdG，這被認為是造成UVB損傷皮膚的重要介質(zhì)之一[3]。艾納香為菊科艾納香屬艾納香[Blumea balsamifera（L.）DC.]的新鮮或干燥地上部分，具有清熱解毒，消腫止痛，止癢等功效，而艾納香油為艾納香中揮發(fā)性成分的提取物是提取天然冰片的附屬產(chǎn)品，含有L-龍腦、樟腦、α-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等主要成分[5]。本研究以Balb/C小鼠為受試動物制備曬傷模型，探討艾納香油是否具有治療皮膚曬傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

Balb/C小鼠（4～6周），80只，雌性，體重18～22 g，購自湖北省實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 藥物與試劑

艾納香油購自貴州省艾源生態(tài)藥業(yè)開發(fā)有限公司（批號：20110116）。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，以85%乙醇稀釋至濃度40%，備用；小鼠8-OHdG ELISA試劑盒購自北京鑫方程生物技術(shù)有限公司（批號：201505）；SOD（批號：20150518）、GSH（批號：20150522）、MDA（批號：20150522）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其他相關(guān)溶劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UVB紫外線燈管（TL20W/12RS，荷蘭PHILIPS公司）；紫外線照度計（UV-340A，臺灣Lutron Electronics公司）；酶標儀（ELX800，美國BioTek公司）；Sartorius CPA225D電子分析天平；紫外分光光度計（DU-800，美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及處理

實驗前2 d在小鼠背部脊柱兩側(cè)剪去體表長毛，面積約為3.0 cm ×3.0 cm，用8%硫化鈉進行脫毛。將脫毛小鼠隨機分為4組：空白對照組（NC）、UVB模型組（UVB）、溶劑組（VC，85%乙醇）、艾納香油組（BB Oil，40%），每組20只[6]。除空白對照組外，對其余各組小鼠進行以下處理：開啟UVB紫外線燈，預(yù)熱15 min，固定光源距小鼠背部距離約為20 cm，照射時間為40 min，照射強度為0.25 mW/cm2，輻照量為600 mJ/cm2[7]；照射期間停止給水給食，照射后0.5 h恢復(fù)。置室溫（24 ±2）℃，濕度50%～60%，12 h白/黑環(huán)境下自由攝食、飲水。

照射后30 min起，開始于照射部位均勻涂抹藥物0.25 mL/只，每天給藥1次，連續(xù)11 d。分別在曬傷后5個時間相點l、2、4、7、11 d，每組每次處死4只小鼠，取小鼠背部皮膚和血液。皮膚組織經(jīng)過漂洗、稱重、勻漿、離心后留上清備用。全血室溫靜置20～30 min后，于4 500 r/min下離心5 min，取上清液得血清，置于-80 ℃冰箱保存，備用[8]。

1.2.2 小鼠曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間觀察

每天在每次給藥前0.5 h觀察小鼠背部的表皮變化，將結(jié)痂完全脫落的時間記為小鼠曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間。

1.2.3 螺旋測微器檢測小鼠背部皮膚厚度

用螺旋測微器測量小鼠背部皮膚厚度并記錄數(shù)據(jù)，每只小鼠取剃毛區(qū)中心背部不同皮膚部位10處進行重復(fù)測量。

1.2.4 小鼠背部皮膚組織含水量測定

每只小鼠取相同部位的背部皮膚，約100 mg，濾紙吸干血液，電子天平稱濕重，并記錄。然后放于80℃烤箱烘烤24 h，取出稱干重，干濕法計算組織含水量。計算公式如下：

組織含水量（%）= ×100%

1.2.5 小鼠血清中SOD與皮膚組織中MDA、GSH測定

用可見光分光光度法檢測已制備的血清中SOD活性和皮膚組織上清液中MDA、GSH的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進行。

1.2.6 小鼠皮膚組織中8-OHdG測定

用酶標儀檢測皮膚組織上清液中8-OHdG的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香油對曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間的影響

曬傷后前2 d，與空白組相比，模型組和溶劑組小鼠背側(cè)出現(xiàn)表皮增厚、脫屑、皺縮現(xiàn)象；艾納香油組小鼠背側(cè)表皮僅有稍許皮膚增厚，無脫屑、皺縮。第3天起曬傷處漸漸形成結(jié)痂并從邊沿開始脫落，艾納香油組的脫落時間明顯快于模型組、溶劑組，模型組完全脫落平均時間為11 d，溶劑組為10.5 d，艾納香油組為9 d（圖1）。

2.2 艾納香油對曬傷皮膚厚度的影響

UVB曬傷后小鼠背部皮膚明顯增厚為（0.53±0.046）mm，與空白對照組（0.27±0.014）mm相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；溶劑組皮膚厚度低于模型組，但高于艾納香油組，與模型組、艾納香油組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第1、2、4、7 天，艾納香油組厚度與模型組相較差異具有顯著性（P<0.01），提示艾納香油可以抑制皮膚增生（圖2）。

2.3 艾納香油對曬傷組織皮膚含水量的影響

紫外線照射后第1 天各組皮膚含水量均較高，艾納香油組>溶劑組>空白組>模型組，且艾納香油組與模型組比較差異有顯著性（P<0.05）。模型組和溶劑組皮膚含水量均隨時間的后移而逐漸下降，在整個治療過程中，艾納香油組皮膚含水量最高，于第4天含水量達最高值（73.13±3.34）%，隨后含水量逐漸下降穩(wěn)定至（69.29±5.10）%，與空白組、模型組、溶劑組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）（圖3）。

2.4 艾納香油對小鼠SOD活力、MDA含量、GSH含量的影響

曬傷后第1、2、4 天，模型組、溶劑組、艾納香油組SOD活性均低于空白組，第1、2天，模型組、溶劑組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且二者SOD活性相仿，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。外涂40%艾納香油后，小鼠血清中SOD活力明顯升高，第1 天與模型組、溶劑組相較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；第2天與模型組相較，差異仍有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；7 d后艾納香油組SOD活性高于空白組，提示艾納香油可增強機體清除氧自由基的能力（圖4）。

曬傷后第1 天，模型組、溶劑組的MDA含量顯著升高，與空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；艾納香油組顯著低于模型組（P<0.01）、溶劑組（P<0.05），高于空白組，但與空白組相較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。曬傷后第2 天，除空白組外，各處理組MDA含量均低于第1 天，但模型組、溶劑組與空白組比較差異仍均有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）；艾納香油組MDA含量仍低于模型組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。曬傷4 d后，隨著機體調(diào)節(jié)和給予相應(yīng)藥物，各處理組小鼠皮膚組織中的MDA含量趨于穩(wěn)定，并恢復(fù)到正常水平，表明艾納香油在曬傷前期能夠有效減少皮膚中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的堆積（圖5）。

曬傷后第1、2 天，模型組、溶劑組GSH含量均低于空白組和艾納香油組，第1 天，模型組、溶劑組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），且兩者SOD活性相仿，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。艾納香油組皮膚中GSH含量明顯升高，第1、2、4 天與模型組相較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示艾納香油可增強皮膚的抗氧化能力（圖6）。

2.5 艾納香油對小鼠皮膚8-OHdG的影響

在整個曬傷治療周期中，除空白組處于穩(wěn)定值外，其他3組8-OHdG含量總體呈上升趨勢。其中，在第1、4、7、11天，模型組、溶劑組8-OHdG含量均高于空白組，且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），而在第1、2、4、7、11天不同的5個時間點，艾納香油組8-OHdG含量均顯著低于模型組和溶劑組，差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），艾納香油組與空白組相較無顯著性差異（P>0.05），提示艾納香油可以促進UVB輻射光產(chǎn)物的清除（圖7）。

3 結(jié)論與討論

過度UV誘導的皮膚氧化損傷，可造成皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、炎癥、異常增生、色素沉著等皮膚曬傷表現(xiàn)，當前市場上缺乏治療曬傷的專用藥[2]。研究表明，艾納香油具有抗氧化、抗菌[9]、治療皮膚燒燙傷[4]的作用，而艾納香油是否能抑制中波紫外線曬傷后諸多表現(xiàn)尚未被證實。本實驗以Balb/C小鼠為對象，進行急性UVB輻射，造成小鼠皮膚曬傷表現(xiàn)，對艾納香油的抗氧化藥效進行檢測，研究結(jié)果顯示，艾納香油可以加速曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落，促進傷口愈合，明顯減輕UVB引起的皮膚增厚。UVB曬傷有一定的促細胞腫脹作用，這也是UVB曬傷引起皮膚炎癥產(chǎn)生的可能機制之一，艾納香油處理后皮膚增厚程度明顯減輕從而降低炎癥發(fā)生。皮膚曬傷后將會出現(xiàn)發(fā)紅、干燥、脫屑、含水量減少、彈性減少等現(xiàn)象，實驗結(jié)果表明，艾納香油在小鼠曬傷后期可升高皮膚的含水量，與模型相、溶劑組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明艾納香油對曬傷皮膚組織的恢復(fù)有良好的促進作用。

紫外線輻射會引起體內(nèi)自由基激增，脂質(zhì)過氧化作用增強，并因此形成脂質(zhì)過氧化物MDA，故MDA的高低間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，對活性氧異常敏感，易被活性氧氧化失活，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能。因而檢測SOD活性對探討皮膚曬傷的病因有重要作用。GSH是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、維持DNA的生物合成及細胞免疫等重要生理功能，GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。8-OHdG是UVB損傷皮膚細胞DNA而產(chǎn)生的主要光產(chǎn)物之一，反映了整個機體平均的氧化損傷率及體內(nèi)DNA氧化損傷與機體正常的修復(fù)作用。本研究中，經(jīng)紫外線曬傷后小鼠SOD活性降低，MDA含量明顯增加，GSH含量下降，與空白對照組各指標變化比較差異有顯著性意義（P<0.05，P<0.01），外涂艾納香油后，小鼠血清中SOD活力明顯升高，皮膚中MDA含量顯著降低，GSH含量顯著升高，差異均有顯著性意義（P<0.05，P<0.01），而且艾納香油組8-OHdG含量均明顯低于模型組和溶劑組（P<0.05，P<0.01），說明艾納香油可增強皮膚對自由基的防護功能，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，減輕UVB輻射造成的DNA損傷，具有較好的抗氧化能力，且起效周期短，給藥前5 d較為明顯。

本實驗僅測定了40%艾納香油對曬傷后小鼠皮膚的抗氧化作用以及對DNA損傷修復(fù)的作用，故下階段試驗中將再增加幾個實驗濃度，同時再設(shè)立使用不同濃度艾納香油而不照射UVB組，以便排除“藥物”本身對皮膚的影響，進一步對血清及皮膚組織中的炎癥介質(zhì)或細胞因子進行檢測，探討艾納香油治療曬傷的藥理作用機制。

參考文獻

[1] 蔣小云，肖風麗. 紫外線與皮膚癌[J]. 中國麻風皮膚病雜志，2013，29（1）：28-30.

[2] 葉小紅，宋洪濤. 中藥治療日曬傷的研究進展[J]. 解放軍藥學學報，2010，26（1）：83-86.

[3] 鄭 欣，吳 嚴，徐天華，等. 抗氧化劑復(fù)合物對急性紫外線照射所致皮膚日曬傷的保護作用[J]. 中國美容醫(yī)學，2012，21（7）：1 170-1 172.

[4] 范佐旺，王 丹，龐玉新，等. 艾納香油對大鼠深Ⅱ度燙傷的治療研究[J]. 中醫(yī)藥信息，2014，31（6）：93-96.

[5] 吳麗芬，龐玉新，楊 全，等. GC法同時測定艾納香油中5個主要成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2015，07：1 179-1 184.

[6] 駱 丹，周炳榮. 黃芩苷對中波紫外線誘導后BALB/c小鼠表皮光產(chǎn)物形成的干預(yù)作用[J]. 中華皮膚科雜志，2009，42（2）：132-134.

[7] Lee C W， Ko H H， Lin C C， et al. Artocarpin attenuates ultraviolet B-induced skin damage in hairless mice by antioxidant and anti-inflammatory effect[J]. Food Chem Toxicol， 2013， 60：123-129.

[8] Silva M A， Trevisan G， Hoffmeister C， et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Aloe saponaria Haw in a model of UVB-induced paw sunburn in rats[J]. J Photochem Photobio B，2014，133：47-54.

[9] 唐暉慧，金美東. 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（6）：47-52.