漾濞大泡與云新高原核桃花粉活力及柱頭可授性比較

胡 青，肖良俊，吳 濤，寧德魯，陳少瑜*

(1.云南省木本油料工程技術(shù)研究中心, 云南 昆明 650201; 2.云南省林業(yè)科學(xué)院, 云南 昆明 650201)

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漾濞大泡與云新高原核桃花粉活力及柱頭可授性比較

胡 青1,2，肖良俊1,2，吳 濤1,2，寧德魯1,2，陳少瑜1,2*

(1.云南省木本油料工程技術(shù)研究中心, 云南 昆明 650201; 2.云南省林業(yè)科學(xué)院, 云南 昆明 650201)

【目的】明確漾濞大泡和云新高原2個核桃品種的花粉活力和柱頭可授性?！痉椒ā坑寐然交牡?TTC)染色法測定花粉在3種貯藏條件下(室溫、冰箱冷藏和冷凍)的活力變化；采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法、過氧化物酶-酯酶試紙法、蘇丹紅染色法3種方法測定不同時期雌花柱頭可授性。【結(jié)果】在相同保存溫度下，云新高原核桃的花粉活力高于漾濞大泡。冰箱冷藏條件有利于花粉保存，保存至第7天時漾濞大泡和云新高原的花粉活力分別從第1天的88.7 %和95.5 %下降至10.0 %和18.3 %。氧化物酶-酯酶試紙法檢測柱頭可授性操作簡單、效果較好?！窘Y(jié)論】漾濞大泡和云新高原核桃的雌花柱頭在V字期開始具有一定的可授性，八字期具有較強(qiáng)的可授性，是其授粉的最佳時期。

深紋核桃；漾濞大泡；云新高原；花粉活力；柱頭可授性

【研究意義】云南種植的核桃主要是深紋核桃(Juglanssigillata)，與中國北方產(chǎn)區(qū)的普通核桃(J.regia)在適生生態(tài)環(huán)境、抗逆性、豐產(chǎn)性及果實(shí)品質(zhì)等方面存在著明顯的差異[1]。漾濞大泡核桃(J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’)是云南傳統(tǒng)主栽的深紋核桃品種，具有個大殼薄、出仁率及含油率高、仁色淺黃、食味香純等優(yōu)點(diǎn)，但存在結(jié)實(shí)晚(約10a 左右)、收益慢等問題。【前人研究進(jìn)展】據(jù)此，云南省林業(yè)科學(xué)院通過種間雜交途徑，即漾濞大泡核桃與新疆早實(shí)核桃進(jìn)行雜交，培育出云新高原(J.sigillata×regiacv. ‘Yunxingaoyuan’)等早實(shí)雜交核桃新品種，并于2004年通過云南省林木品種審定委員會審定[2-3]。云新高原經(jīng)過嫁接繁殖，1年生嫁接苗定植后2～3年開花結(jié)果，5年進(jìn)入初盛果期，其果實(shí)比漾濞大泡核桃提早20～35 d成熟[3]。云新高原早實(shí)、早熟、優(yōu)質(zhì)及樹體矮化等性狀穩(wěn)定，但產(chǎn)量不夠穩(wěn)定，其主要原因之一就是核桃為雌雄同株異花異熟的風(fēng)媒授粉植物，花期不一致和雌花受粉高峰期較短不利于其傳粉坐果，因此，配置適宜的授粉樹品種可提高結(jié)實(shí)率，增加產(chǎn)量[4]?；ǚ刍盍椭^可授性是影響授粉受精的兩個非常重要制約因子，只有充分了解不同核桃品種的花粉活力和柱頭可授性特點(diǎn)，才可能科學(xué)地進(jìn)行樹種配置，提高授粉受精率，進(jìn)而提高結(jié)實(shí)率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)核桃花粉活力和柱頭可授性研究都集中于普通核桃[5-9]，深紋核桃及雜交種相關(guān)方面的研究未見報道。另外，云南省核桃種植面積截止2015年底時已達(dá)282萬hm2，干果產(chǎn)量達(dá)到85萬t，產(chǎn)值為281.5億元，面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國之首[10]。進(jìn)一步利用云南豐富的種質(zhì)資源選育出適應(yīng)性更廣、品質(zhì)更優(yōu)良的核桃品種成為當(dāng)前云南核桃培育工作的重要內(nèi)容?！緮M解決的關(guān)鍵問題】雜交育種是核桃新品種培育的重要途徑，保證花粉具有生命力和柱頭在適宜的可授期是確保雜交育種成功的前提條件。因此，研究核桃花粉生活力、花粉適宜的保存溫度及柱頭可授性具有重要的應(yīng)用價值。本研究以漾濞大泡核桃和云新高原核桃2個品種為研究對象，測定不同保存條件下二者花粉活力情況及柱頭不同時期的可授性，篩選出適宜的花粉貯藏方式及其柱頭可授性最佳時期，為這2個核桃品種相關(guān)的人工授粉和雜交育種工作提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

研究地點(diǎn)位于昆明市盤龍區(qū)云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹木園的核桃種質(zhì)資源收集圃內(nèi)。海拔1970 m，年平均氣溫14.7 ℃，絕對最低溫-7.8 ℃，絕對最高溫31.5 ℃，年≥10 ℃的積溫4799.3 ℃，平均霜期85 d，年降水量1100 mm，相對濕度72 %，全年日照時數(shù)大于2249.3 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

漾濞大泡和云新高原核桃均為嫁接苗，株齡分別為15年生和12年生，每品種3～5株作為觀察和采樣對象。

1.3 研究方法

1.3.1 花粉活力測定 采集盛花期樹體中上部，花藥變黃、松散但尚未開裂的雄花序，平鋪在硫酸紙上，置于25 ℃溫箱內(nèi)任其花藥自然開裂散粉。次日，收集花粉于2 mL離心管中密封，分別放置于室溫、冰箱冷藏室(4±2 ℃)和冰箱冷凍室(-20±2 ℃)中保存。用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法進(jìn)行花粉活力測定[11]。測定時，將0.1 %的TTC滴于載玻片上，用毛筆蘸花粉后將其抖落在TTC液滴上，蓋上蓋玻片，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于培養(yǎng)箱中30 ℃下避光放置24 h。在顯微鏡下觀察花粉著色情況，紅色的記為有生活力的花粉。每個載玻片觀察6個視野，共觀察3個載玻片。

花粉活力( %)=(著色花粉數(shù)量/總的花粉數(shù)量)×100。

1.3.2 雌花柱頭可授性檢測 采用3種方法進(jìn)行柱頭可授性檢測，測定核桃雌花從開花到謝花這段時間柱頭可授性的變化，確定雌花開花后柱頭具備可授性的時期[12]。①聯(lián)苯胺-過氧化氫法(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的聯(lián)苯胺∶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的過氧化氫∶水 = 4∶11∶22，體積比)。將不同開花時期的核桃雌花柱頭切下，浸入添加了新制聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液的離心管蓋中，觀察柱頭顏色變化和產(chǎn)生氣泡的情況。②過氧化物酶-酯酶試紙法。取15 mm × 15 mm大小的試紙溶于1 mL雙蒸水中，將柱頭浸入該試紙水溶液中，如柱頭變藍(lán)，則柱頭進(jìn)入可授期。③蘇丹紅染色法。將切下的柱頭浸入2 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蘇丹紅溶液中，觀察柱頭脂類分泌物的變化情況，根據(jù)柱頭表面出現(xiàn)被染成紅色油滴狀物質(zhì)的多少判斷其可授性。每種方法每次檢測5朵花，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存條件對花粉活力的影響

由圖1可知，在相同保存條件下，云新高原的花粉活力整體高于漾濞大泡核桃1.8 %～3.8 %，且差異性不顯著(P=0.83～0.93 > 0.05)，說明在常溫、冷藏和冷凍保存條件下二者的花粉活力一致，無明顯區(qū)別。但不同保存條件下花粉活力差異較大，冷藏條件下保存的漾濞大泡和云新高原的花粉活力最高，分別從保存第1天的88.7 %和95.5 %下降至第7天的10 %和18 %。而常溫保存的漾濞大泡和云新高原的花粉活力最低，分別從保存第1天的82.7 %和88.5 %下降至第7天的0.4 %和3.5 %。冷凍保存的花粉活力介于室溫保存和冷藏保存之間。

圖1 不同保存條件下漾濞大泡和云新高原花粉活力變化Fig.1 Pollen viability of Yangbidapao and Yunxingaoyuan at different preserved conditions

圖2 不同時期的雌花柱頭及其染色結(jié)果Fig.2 Stigma receptivity and its detection results of pistil stigma at each development stage

2.2 雌花開花進(jìn)程的形態(tài)變化

漾濞大泡和云新高原的雌花花期均為10～12 d，但漾濞大泡的雌花花期比云新高原晚22～24 d，云新高原的雌花于3月4日進(jìn)入初花期，3月8日進(jìn)入盛花期，3月14日進(jìn)入末花期；漾濞大泡于3月26日進(jìn)入初花期，4月1日進(jìn)入盛花期，4月7日進(jìn)入末花期。二者雌花花期的外部形態(tài)變化一致，根據(jù)外部形態(tài)變化，可將其分成5個階段(圖2)，即顯花期、初開期、V字期、八字期和翻卷期。顯花期花閉合，柱頭包裹其中，持續(xù)3～5 d。初開期，花被開裂，柱頭伸展并高出花被，略開張，兩裂柱頭夾角5°～15°，可見柱頭表面具突觸狀的腺質(zhì)細(xì)胞，漾濞大泡的腺質(zhì)細(xì)胞呈淺粉紅色，云新高原呈嫩綠色，持續(xù)1～2 d。V字期，柱頭伸長并張開呈V字型，柱頭夾角15°～45°，持續(xù)1～2 d。八字期，柱頭夾角45°～120°，腺質(zhì)細(xì)胞充分伸展，表面可見濕性分泌物，此時期持續(xù)時間因是否授粉而有所不同，經(jīng)過授粉比未授粉的柱頭較快變干并翻卷，干熱或大風(fēng)氣候也會使柱頭較快干縮，持續(xù)1～5 d。翻卷期，柱頭平展并向下翻卷，柱頭夾角基本不再變化，柱頭萎蔫逐漸干枯，持續(xù)2～3 d。雌花的子房從顯花期到八字期生長膨大，最粗直徑從2～3 mm增至5 mm左右，子房未膨大的雌花在花期結(jié)束前萎蔫枯黃自花柄端脫落。

2.3 柱頭可授性檢測結(jié)果

過氧化物酶-酯酶法和蘇丹紅法檢測漾濞大泡和云新高原雌蕊柱頭可授性時，可觀察到明顯的顏色變化，而聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測時，柱頭有大量氣泡產(chǎn)生，少許腺質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)黑色，但顏色變化不明顯，不利于結(jié)果的觀察。

氧化物酶-酯酶法和蘇丹紅法染色結(jié)果(圖2)可以看出，雌花初開期，經(jīng)檢測在柱頭邊緣的觸突狀腺質(zhì)細(xì)胞具有較弱的可授性。隨著柱頭生長和張開角度逐漸增大，其表面的觸突狀腺質(zhì)細(xì)胞伸展、光亮，有黏液產(chǎn)生，經(jīng)檢測八字期具有較強(qiáng)的可授性，表現(xiàn)為柱頭變色快、著色深，著色部位主要集中在柱頭表面。翻卷期如果觸突狀腺質(zhì)細(xì)胞還不干枯，則仍能染色明顯；如果腺質(zhì)細(xì)胞干枯，則染色不明顯。漾濞大泡和云新高原的染色觀察結(jié)果基本一致，均在V字期開始具有一定的可授性，八字期具有較強(qiáng)的可授性，翻卷期柱頭萎蔫后不具可授性。

3 討 論

花粉具有活力是完成受精的必要條件，既受物種和品種自身內(nèi)在遺傳因素的影響，又受溫度、濕度、光照等外部環(huán)境因素的影響[13]。在諸多的環(huán)境因素中，溫度和濕度是影響花粉壽命的主要因子，是選擇花粉貯藏方法時必須著重考慮的因素。在室溫條件下，花粉的壽命往往很短。如蘋果花粉在常溫條件下經(jīng)7～8 d，西南樺、光皮樺的花粉經(jīng)3～4 d即失去活力[14]。蘋果、杜梨、桃和棗等12種果樹的花粉貯藏研究結(jié)果表明，冰箱冷凍室的貯藏效果明顯優(yōu)于冷藏室，花粉離體萌發(fā)率可提高7.5 %～27.2 %[15-16]。親緣關(guān)系越近的植物種類，其花粉壽命越一致[17]。漾濞大泡核桃和普通核桃同屬胡桃屬，云新高原是二者的種間雜交種，已有的普通核桃花粉活力相關(guān)文獻(xiàn)與本項(xiàng)研究結(jié)果具有很好的參考比較價值。

杜晉城等[9]測定4種溫度條件下保存的花粉活力，室溫為10～12 d；2～5 ℃ 為25～28 d；-20 ℃為10 d；-70 ℃保存時間不到1 d。任列花[5]、齊國輝[6]、劉昊[7]、緱鋒利[8]等的研究，普通核桃花粉常溫下多數(shù)品種能保持4～7 d，4 ℃冰箱冷藏能保持10～20 d，4 ℃冰箱的溫濕度對于保持花粉活力比較適宜。本研究檢測核桃花粉活力，漾濞大泡和云新高原剛散粉時花粉活力高達(dá)88.7 %和95.5 %，隨保存時間的延長而下降；不同保存條件對核桃花粉活力影響較大。4 ℃冰箱冷藏保持花粉活力比較適宜，漾濞大泡和云新高原保存7 d后花粉活力還能達(dá)到10.0 %和18.3 %；而自然狀態(tài)下花粉活力喪失較快，保存7 d 后只有0.4 %和3.5 %，基本喪失活力；-20 ℃冰箱冷凍保存的花粉活力介于室溫和冷藏之間，結(jié)論與普通核桃的研究[7-8]基本一致，但遠(yuǎn)低于杜晉城等[9]的研究結(jié)果，高于齊國輝等[6]的研究結(jié)果?？赡苁俏锓N及品種不同的緣故，或是花粉采收時含水率不同及保存環(huán)境的濕度差異所致。因而花粉的保存，需要綜合考慮物種、品種、溫度、濕度等因素，以期達(dá)到最佳保存時間，滿足人工授粉和雜交育種工作的要求。

柱頭可授性是花朵成熟過程中的一個重要時期，它能在很大程度上影響開花不同階段的傳粉成功率。不同植物的柱頭可授性差異較大，白楊派樹種進(jìn)入最佳授粉時期時的柱頭開裂角度約為180°[13]；美國山核桃品種馬漢柱頭開裂明顯，初花期并無可授性，V字期可授性逐漸增強(qiáng)并持續(xù)至倒八字初期，該階段為授粉最佳時期[18]。核桃柱頭伸出略張開時已具有可授性，柱頭開裂角度為90°～120°時可授性最強(qiáng)[7]。深紋核桃雌花初花期到未花期大概需要20 d左右，期間雌花柱頭和子房會發(fā)生外部形體的變化，為準(zhǔn)確界定和區(qū)分雌花柱頭可授性的適宜時期，根據(jù)雌花柱頭開花形態(tài)可劃分為5個時期——顯花期、初開期、V字期、八字期和翻卷期，與劉昊[7]、張琴和劉德良[19]的研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本研究檢測的漾濞大泡和云新高原核桃花粉活力隨保存時間的延長而下降，不同保存條件對核桃花粉活力影響較大，4 ℃冰箱冷藏保持花粉活力比較適宜。本研究，采用了聯(lián)苯胺-過氧化氫法、蘇丹紅染色法和過氧化物酶-酯酶試紙法進(jìn)行雌花柱頭可授粉性的檢測，氧化物酶-酯酶試紙法檢測柱頭可授性的成本較高，但效果、簡便性優(yōu)于聯(lián)苯胺-過氧化氫法和蘇丹紅染色法，可優(yōu)先考慮。對漾濞大泡和云新高原核桃柱頭可授性檢測結(jié)果表明，柱頭在V字期開始具有一定的可授性，八字期具有較強(qiáng)的可授性，翻卷期可授性喪失。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Study on Pollen Viability and Stigma Receptivity of Two Walnut Cultivars Yangbidapao and Yunxingaoyuan

HU Qing1,2, XIAO Liang-jun1,2, WU Tao1,2, NING De-lu1,2, CHEN Shao-yu1,2*

(1.The Woody Oil Engineering Research Center of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650201, China；2.Yunnan Academy of Forestry, Yunnan Kunming 650201, China)

【Objective】The pollen viability and stigma receptivity of two walnut cultivars (J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’ andJ.sigillata×regiacv. ‘Yunxingaoyuan’) planted in Kunming were studied in this paper. 【Method】The period and conditions (room temperature, cold-storage and frozen-storage) for keeping high pollen viability were detected by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method. The stigma receptivity and optimal pollination period were evaluated by benzidine-H2O2, peroxidase-esterase reagent and sudan Ⅲ staining method. 【Result】The results showed that the pollen viability of Yunxingaoyuan was higher than that of Yangbidapao at the same storage condition. The cold-storage was conducive to keeping high pollen viability, and which of Yangbidapao and Yunxingaoyuan were decreased to 10.0 % and 18.3 % respectively after seven days. 【Conclusion】The peroxidase-esterase reagent method was the best way to monitor the stigma receptivity, and the best period of pollination was the stigma opening angle ranging from 45 to 120 degrees.

Juglanssigillata；Yangbidapao；Yunxingaoyuan；Pollen viability；Stigma receptivity

1001-4829(2017)6-1434-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.033

2016-05-23

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃青年項(xiàng)目(2013FD075)；國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2011BAD46B01)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660214)

胡 青(1986-)，女，江西吉安人，博士，從事生態(tài)學(xué)研究，E-mail: qing-hu08@163.com，*為通訊作者：陳少瑜，E-mail: sherry9872@163.com。

S718.3

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