天津地區(qū)辣椒病毒病調(diào)查及毒源種類初步鑒定

高葦　王勇　張春祥　張安盛　竺曉平

摘要：本研究對天津5個區(qū)縣辣椒病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行初步調(diào)查，并利用6種常見蔬菜病毒的抗體采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAs-ELISA）鑒定采集到的228份病毒樣品。結(jié)果表明，有186份樣品呈陽性，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）檢出率最高，達(dá)42.25%，為天津地區(qū)辣椒的優(yōu)勢毒源種類；煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbean wilt virus，BBWV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）檢出率分別為37.43%、28.34%、17.65%和20.86%；并首次在天津武清地區(qū)檢出番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilf virus，TSWV）侵染辣椒。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)天津地區(qū)辣椒存在2種及2種以上病毒復(fù)合侵染。

關(guān)鍵詞：辣椒；辣椒病毒病；ELISA檢測；病原鑒定；天津

中圖分類號：S436.418.1⁺2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0091—04

辣椒（Capsicum annuum L.）作為全世界重要的蔬菜作物，是人們生活中必備的蔬菜和調(diào)味品，目前我國辣椒栽培面積和總產(chǎn)量位居世界第一位。近年來，隨著設(shè)施栽培技術(shù)的發(fā)展、田間濕度的增加，辣椒病害發(fā)生的種類增多，發(fā)生程度加重，其中辣椒病毒病的發(fā)生更為嚴(yán)重。1923年，Doolittle首次報道了黃瓜花葉病毒（CMV）侵染辣椒，到目前為止已報道的侵染辣椒的病毒種類至少有45種。近年來，隨著栽培環(huán)境和氣候條件的變化，辣椒病毒病在天津地區(qū)有日益加重的趨勢，一般年發(fā)病率在30%～50%，導(dǎo)致減產(chǎn)10%～30%左右，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)甚至絕收，對辣椒生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

不同毒源引起的辣椒病毒病在癥狀上具有相似性，主要表現(xiàn)為黃化、蕨葉、植株矮小等，難以從癥狀上確定毒源的種類。目前，還沒有系統(tǒng)地鑒定過危害天津地區(qū)辣椒的主要毒源種類，因此生產(chǎn)上對辣椒病毒病的防治存在較大的盲目性。2013年，筆者在天津市5個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)縣進(jìn)行了大量病害調(diào)查及病毒樣本采集，并利用DAS-ELISA檢測方法對病毒樣本進(jìn)行鑒定，以明確天津地區(qū)辣椒病毒病的發(fā)生情況和主要毒源種類，為天津地區(qū)辣椒病毒病的防治及抗病育種工作的開展提供參考和依據(jù)。

1材料與方法

1.1發(fā)病情況調(diào)查與樣品采集

2013年，在天津市周邊5個區(qū)縣（武清區(qū)、西青區(qū)、北辰區(qū)、寧河縣和靜?？h）辣椒種植基地25塊生產(chǎn)田開展辣椒病毒病調(diào)查，并隨機采集葉片黃化、畸形、皺縮，植株矮小等疑似感染病毒病的樣本。將樣本統(tǒng)一編號、照相和癥狀記載，并分別裝入標(biāo)記的自封袋中，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣本處理

取樣本在預(yù)冷的研缽中研磨均勻，將獲得汁液與樣品提取緩沖液按1：10的比例稀釋，4000r/min、4℃下離心5 min，取上清液進(jìn)行DAS-ELISA檢測。

1.3 ELISA檢測

將CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV、TYLCV六種包被抗體（AC Diagnostics公司提供）分別加入到酶標(biāo)板孔中，置于4℃條件下包被過夜。棄去包被液，充分洗滌3次，吸去孔內(nèi)殘液。將100μ1.2中獲得的樣本液作為待測抗原加入到酶標(biāo)板中并做好標(biāo)記（陽性對照加入100 μL相應(yīng)病毒陽性樣品，陰性對照加入100μL樣品稀釋緩沖液），26℃下孵育2 h，倒掉液體，洗滌3次，吸水紙吸干孔內(nèi)殘液。加入現(xiàn)配的堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗，37℃溫育2 h。洗滌后，采用新鮮配制的PNP底物溶液進(jìn)行顯色。用ELX800酶標(biāo)儀在405 nm處測定各反應(yīng)OD值，通過檢測樣本OD值（P）和陰性樣本OD值（N）的比值，判斷抗血清的效價。P/N>2.0時為陽性反應(yīng)，P/N<1.5為陰性反應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1天津地區(qū)辣椒病毒病的發(fā)生情況

于天津5個區(qū)縣共采集到疑似辣椒病毒病樣本228份，發(fā)現(xiàn)天津地區(qū)辣椒病毒病發(fā)生較為嚴(yán)重，其癥狀主要表現(xiàn)為蕨葉型（圖1a）、花葉型（圖1b）和黃綠相間斑駁型（圖1c），花期表現(xiàn)為開花率較低，發(fā)病后期整株矮小。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，露地栽培辣椒病毒病的發(fā)病率顯著高于溫室栽培辣椒；武清地區(qū)蕨葉型辣椒病毒病的發(fā)生較為普遍，發(fā)病率最高田塊可達(dá)70%左右；靜?？h辣椒病毒病的主要癥狀以花葉型為主，發(fā)病率最高田塊可達(dá)80%；而西青區(qū)、北辰區(qū)和寧河縣辣椒病毒病發(fā)生率較低，少于20%，大多是花葉和蕨葉型混發(fā)（表1）。

2.2辣椒病毒樣本DAS-ELISA檢測

對228份疑似辣椒病毒病樣品進(jìn)行DAS-ELISA檢測進(jìn)而判斷其致病毒源種類，結(jié)果表明，有186份樣本呈陽性反應(yīng)，受到CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六種病毒中的1種或1種以上侵染。其中，CMV病毒檢出率最高，為42.25%，TMV、ToMV、BBWV和TYLCV病毒的檢出率分別為37.43%、28.34%、17.65%和20.86%，同時在武清區(qū)檢出1份TSWV病毒侵染樣本，為天津地區(qū)首次檢出報道。天津5個區(qū)縣辣椒病毒病的毒源種類具有明顯差異（圖2），CMV和TMV為兩種主要毒源種類。武清區(qū)和西青區(qū)毒源以CMV為主；北辰區(qū)和靜?？h主要毒源為TMV；寧河縣毒源種類較為豐富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4種病毒的檢出率相似，均在30%左右。

2.3病毒復(fù)合侵染

DAS-ELISA檢測顯示，186份陽性樣品中，單一病毒侵染率為44.09%，有104份樣品（55.91%）檢測到2種或2種以上病毒侵染，說明天津地區(qū)辣椒病毒病毒源種類豐富，復(fù)合侵染率較高（表2）。在辣椒病毒病復(fù)合侵染中以2種病毒復(fù)合侵染為主，共有85份。其中，CMV和TMV病毒混發(fā)的檢出率最高，為13.60%，主要在武清和西青地區(qū)樣本中檢出。另外，CMV與ToMV混發(fā)樣本檢出率為8.33%，這與田間癥狀多以花葉和蕨葉混發(fā)為主的特征一致。2種病毒復(fù)合侵染以CMV、TYLCV、BBWV與其它病毒混合侵染為主。其中，BBWV復(fù)合侵染的病毒檢出樣本均采自寧河縣造甲城鎮(zhèn)造甲村露地栽培的辣椒上，可能與當(dāng)?shù)芈兜卦耘嗥贩N復(fù)雜、不同蔬菜品種上的病毒復(fù)合侵染有關(guān)。ToMV與其它病毒混發(fā)樣本主要集中在靜海和寧河縣。3種病毒復(fù)合侵染的檢出率顯著低于2種病毒復(fù)合侵染，CMV+TYLCV+ToMV檢出率為2.63%，ToMV+TYLCV+BBWV檢出率為3.51%，TMV+BBWV+ToMV檢出率1.75%。另外，在天津地區(qū)僅檢出1份樣本受到4種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染病毒種類為CMV+TMV+TYLCV+BBWV，該樣本采自寧河縣露地栽培辣椒。

3結(jié)論與討論

近年來，辣椒病毒病的發(fā)生尤為嚴(yán)重，由原來的次要病害逐漸上升為主要病害，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究對天津地區(qū)辣椒病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)辣椒病毒病的發(fā)生率平均在20%～30%，露地辣椒的發(fā)生率顯著高于設(shè)施栽培辣椒，這與病毒病的傳播媒介主要為蚜蟲、薊馬、粉虱等具有顯著相關(guān)性。天津地區(qū)辣椒病毒病的癥狀以黃化、蕨葉、花葉、皺縮、植株矮小為主，難以從癥狀上判斷病原種類，一旦發(fā)生難以控制，顯著降低辣椒產(chǎn)量和農(nóng)民收入。本研究利用DAS-ELISA方法對天津地區(qū)采集的辣椒病毒病樣品進(jìn)行毒源鑒定，結(jié)果CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六種常見病毒均有檢出，其中TSWV病毒為天津地區(qū)的首次檢出報道。目前，我國北京、遼寧、江蘇、吉林、四川、陜西、重慶等地區(qū)均廣泛開展了辣椒病毒病毒源種類調(diào)查，先后報道了CMV、TMV、PVX、PVY、TEV、PMMoV、AMV、BBWV、TSWV、TYLCV、GYSV、CaCV、TMGMV等16種病毒侵染辣椒。調(diào)查顯示辣椒病毒病的主要毒源以CMV和TMV為主，而且常常是2種或2種以上病毒復(fù)合侵染，這與天津地區(qū)辣椒病毒病的發(fā)生及種類具有相似性。天津地區(qū)不同區(qū)縣優(yōu)勢毒源種類具有明顯差異，武清區(qū)和西青區(qū)毒源以CMV為主；北辰區(qū)和靜?？h主要毒源為TMV；寧河縣毒源種類較為豐富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4種病毒的檢出率相似，均在30%左右，這很可能與當(dāng)?shù)氐脑耘喹h(huán)境及栽培品種有關(guān)。此外，病毒CMV極易與其它毒源復(fù)合侵染，常表現(xiàn)為2種病毒復(fù)合侵染，占總陽性樣本檢出率的31.18%。另外，露地栽培辣椒病毒復(fù)合侵染的發(fā)生率顯著高于設(shè)施栽培辣椒，這與露地混合栽培品種多樣、易發(fā)生交叉侵染相關(guān)。結(jié)合檢測結(jié)果及病毒病發(fā)生特點分析，筆者認(rèn)為辣椒病毒病防治應(yīng)主要采取預(yù)防措施，通過有效應(yīng)用防蟲網(wǎng)、黃板等手段避免傳播媒介滋生、擴(kuò)散。

本研究僅采用6種常見蔬菜病毒抗體對采集到的228份疑似樣本進(jìn)行檢測，無法涵蓋天津地區(qū)辣椒病毒病的所有毒源種類，該地區(qū)是否有其它毒源種類仍需進(jìn)一步鑒定。另外，由于病毒病癥狀復(fù)雜，無法將毒源種類和癥狀進(jìn)行顯著關(guān)聯(lián)，對于辣椒病毒病癥狀診斷的實現(xiàn)有待進(jìn)一步研究。