一株蠟樣芽胞桿菌B—21的發(fā)酵優(yōu)化

閆洪雪 李麗 劉露 梁文輝 張鵬鵬 趙宏濤

摘要：對蠟樣芽胞桿菌B-21的生長情況進(jìn)行培養(yǎng)觀測，通過最適溫度及最適初始pH值的選擇、碳氮源的單因素試驗(yàn)確定最適培養(yǎng)條件及最適碳氮源。采用正交試驗(yàn)的方法進(jìn)一步確定各培養(yǎng)組分的最適配比，最終確定該菌培養(yǎng)基的有機(jī)組分最適用量為葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆餅粉6g/L，發(fā)酵菌數(shù)最高可達(dá)到120×10⁸cfu/mL。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽胞桿菌；培養(yǎng)優(yōu)化；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0062—04

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種革蘭氏陽性菌，能夠形成芽胞，且芽胞有較強(qiáng)的抵御不良條件的抗性，能夠適應(yīng)各種不同的環(huán)境生長。大多數(shù)蠟樣芽胞桿菌菌種與動植物有密切共生關(guān)系，且能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如各種蛋白酶、淀粉酶、抗菌素、纖維素酶，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、飼料、食品、保健品等領(lǐng)域。近年研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌作為植物根際促生菌（PGPR）具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力，是土壤中的優(yōu)勢菌，它能夠促進(jìn)植物生長，且對多種植物病害有明顯的抑制作用。

本試驗(yàn)中所提及的蠟樣芽胞桿菌是從蘋果根系土壤中篩選獲得，經(jīng)鑒定為益生菌，具有抑菌作用。通過對該菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化，提高其發(fā)酵活菌數(shù)，可進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，與本公司海藻肥料相結(jié)合，開發(fā)出抑菌促生的新型蘋果肥料，進(jìn)一步提高蘋果的產(chǎn)量與質(zhì)量。

1材料與方法

1.1菌種

本試驗(yàn)所用蠟樣芽胞桿菌是從蘋果根系土壤中篩選所得，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑

超凈工作臺SW-CJ-2F（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床THZ-D（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、渦旋振蕩器（澳門市其林貝爾儀器制造有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱LRH-150B（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)UV-5100-5800（上海精密儀器廠）。

所用試劑為蛋白胨、玉米粉、酵母粉、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糊精、玉米淀粉、脫脂豆粉、蔗糖、牛肉粉、NaCl、KH₂PO₄、（NH₄）₂SO₄、CaCO₃、NaOH、HCl、pH試紙。

1.3生長曲線的測定

斜面活化的B-21菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。B-21菌懸液的OD值反映其隨著培養(yǎng)時(shí)間的菌數(shù)變化。在培養(yǎng)不同時(shí)間取樣，檢測菌懸液在波長為600 nm時(shí)的吸光度，繪制B-21菌株的生長曲線。

1.4培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.1培養(yǎng)溫度的選擇取1 mL對數(shù)期種子培養(yǎng)液接人50 mL滅菌前pH為7.0的LB液體培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度梯度為26、28、30、32、34、36℃，搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)至芽胞轉(zhuǎn)化率95%以上停止培養(yǎng)，稀釋涂布法測菌數(shù)。

1.4.2初始pH值的選擇取1 mL對數(shù)期種子培養(yǎng)液接入50 mL滅菌前pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的液體LB培養(yǎng)基中，設(shè)置轉(zhuǎn)速180 r/min，32℃搖床培養(yǎng)，至芽胞轉(zhuǎn)化率95%以上，稀釋涂布法測菌數(shù)。

1.5單因素試驗(yàn)

1.5.1最適碳源選擇 分別以玉米粉、玉米淀粉、蔗糖和麥芽糊精作為長效碳源，用量為7g/L，其余成分為葡萄糖7g/L，豆餅粉6g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L配培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)滅菌前培養(yǎng)基的pH值為7.5。接種B-21菌株后，32℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。鏡檢觀察待芽胞轉(zhuǎn)化率95%以上時(shí)，稀釋涂布法計(jì)菌數(shù)。

1.5.2最適氮源選擇 分別以豆餅粉、牛肉粉、脫脂豆粉和蛋白胨作為單因素改變氮源，用量為6g/L，其余成分為玉米淀粉7g/L，葡萄糖7g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L配培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)滅菌前培養(yǎng)基的pH值為7.5。接種B-21菌株后，32℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。鏡檢觀察，待芽胞轉(zhuǎn)化率為95%以上時(shí)，稀釋涂布法計(jì)菌數(shù)。

1.6最佳配比選擇及驗(yàn)證

根據(jù)L₁₆（4⁵）正交表，以該表前三列為準(zhǔn)，設(shè)計(jì)三因素四水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)變量的三個(gè)因素分別為葡萄糖、玉米淀粉、豆餅粉，對應(yīng)的四個(gè)水平分別是4、5、6、7g/L；5、6、7、8g/L；4、6、8、10g/L。其他成分為硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L。調(diào)節(jié)滅菌前培養(yǎng)基pH值為7.5。

將B-21蠟樣芽胞桿菌分別接種到16瓶培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。鏡檢觀察，待芽胞轉(zhuǎn)化率95%以上時(shí)，稀釋涂布法計(jì)菌數(shù)。

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)正交試驗(yàn)分析得出最佳配比后，再根據(jù)該組合各成分的配比配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)滅菌前培養(yǎng)基pH值為7.5，32℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)該菌株，待芽胞轉(zhuǎn)化率95%以上時(shí)，稀釋涂布法計(jì)菌數(shù)，以驗(yàn)證最優(yōu)組合的可靠性。

1.7數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2003分別統(tǒng)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)后的活菌數(shù)，制作圖表，得到該菌株的生長曲線、最適培養(yǎng)條件及最適培養(yǎng)基成分及配比。

2結(jié)果與分析

2.1 B-21的生長曲線

在不同時(shí)間取樣后，測得600 nm波長下B-21菌液的吸光度值，結(jié)果表明，用LB培養(yǎng)，B-21在培養(yǎng)3～16 h處于對數(shù)生長期，16 h的OD值超過1.5，在20～24 h達(dá)到最高峰，之后處于緩慢下降趨勢（圖1）。

2.2最適培養(yǎng)溫度

用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)B-21菌株，培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、32、34、36℃，發(fā)酵結(jié)束后計(jì)數(shù)結(jié)果表明，該菌的最適培養(yǎng)溫度是32℃（圖2）。

2.3滅菌前最適pH值

32℃條件下，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)B-21菌株，在不同初始pH值培養(yǎng)基培養(yǎng)后的計(jì)數(shù)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示該菌培養(yǎng)的滅菌前最適pH值為7.5。

2.4最適碳源

通過用不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵后計(jì)數(shù)結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，使用玉米淀粉做碳源的處理B-21菌數(shù)最多，數(shù)量達(dá)到78×10⁸cfu/mL以上，因此培養(yǎng)該菌的最適碳源為玉米淀粉。

2.5最適氮源

確定最適碳源后，單因素改變氮源，發(fā)酵結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)的菌數(shù)結(jié)果（圖5）顯示，培養(yǎng)B-21的最佳氮源為豆餅粉。試驗(yàn)過程中脫脂豆粉菌數(shù)也較高，但重復(fù)試驗(yàn)不穩(wěn)定，故選擇豆餅粉作為最佳氮源。

2.6正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)確定最適碳源、氮源后，為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)的方法對培養(yǎng)基的有機(jī)組分進(jìn)行試驗(yàn)，尋找最佳配比。統(tǒng)計(jì)的菌數(shù)結(jié)果如表1所示。

從表1中可看出，B-21的最佳培養(yǎng)基有機(jī)組分為葡萄糖7g/L，玉米淀粉8g/L，豆餅粉6g/L。極差分析可知，各因子對活菌數(shù)影響的大小為葡萄糖>玉米淀粉>豆餅粉。

進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以最佳處理組合的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)B-21菌株，菌量達(dá)120×10⁸cfu/mL，表明培養(yǎng)基有機(jī)組分為葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆餅粉6g/L即為本試驗(yàn)的最佳處理組合。

3結(jié)論與討論

蠟樣芽胞桿菌近年來廣泛應(yīng)用于動物飼料、食品與保健、植物肥料等的生產(chǎn)，具有促生與抑菌的作用。本研究通過觀察一株蠟樣芽胞桿菌B-21的生長情況，通過一系列試驗(yàn)，確定了其最佳培養(yǎng)溫度為32℃，最適初始pH值為7.5，最佳碳源為玉米淀粉，最佳氮源為豆餅粉。并通過正交試驗(yàn)的進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)，確定了高產(chǎn)的培養(yǎng)基成分及最佳碳氮源配比，可使發(fā)酵菌數(shù)最高達(dá)到120×10⁸cfu/mL，為之后用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供了良好依據(jù)，為與本公司海藻肥料相結(jié)合，開發(fā)新型肥料奠定了基礎(chǔ)。