鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞收縮的實驗?zāi)Ｐ徒?/h1>

2016-05-30 07:53:17曾瑋娓劉紅星唐暉

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關(guān)鍵詞：模型

曾瑋娓 劉紅星 唐暉

【摘要】：目的：建立骨骼肌細(xì)胞收縮模型。方法：以C2C12細(xì)胞株為實驗對象，以不同濃度鈣負(fù)荷（0uM、10uM、25uM、50uM、75uM、100uM）為刺激條件，通過電鏡觀察和檢測培養(yǎng)液葡萄糖濃度來確定骨骼肌細(xì)胞收縮。結(jié)果： 不同濃度鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞收縮的程度不同。與A組（0uM，不加鈣）相比，B（10uM）組的葡萄糖濃度沒有顯著性差異（P>0.05），C（25uM）、D（50uM）、E（75uM）、F（100uM）組均顯著降低（P<0.05），顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)B組出現(xiàn)輕度收縮反應(yīng)，C組出現(xiàn)較明顯收縮反應(yīng)，D、E組出現(xiàn)明顯收縮反應(yīng)，F(xiàn)組出現(xiàn)較強收縮反應(yīng)。結(jié)論：100uM鈣符負(fù)荷可引起明顯的骨骼肌收縮反應(yīng)，因此可以此濃度建立鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞收縮模型。

【關(guān)鍵詞】：鈣負(fù)荷；骨骼肌細(xì)胞；收縮；模型

骨骼肌收縮是運動的基礎(chǔ)和前提。然而，運動人體科學(xué)工作者在研究人體對運動的反應(yīng)和適應(yīng)規(guī)律時，絕大部分都是處于在體狀態(tài)。人們很難從根本上研究骨骼肌在收縮時的機能變化情況。因此，建立骨骼肌細(xì)胞收縮模型就成為運動人體科學(xué)亟待解決的問題之一。

自從1997年Thelen[1]等人首先報到采用低頻電刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)的肌管收縮以來，國內(nèi)外已有較多的文獻也利用此方式進行各自的研究[2-5]。然而，這種刺激方式并不太符合肌肉收縮的規(guī)律。眾所周知，人體的骨骼肌收縮是神經(jīng)興奮傳到神經(jīng)肌肉接頭，通過化學(xué)遞質(zhì)將興奮傳到肌細(xì)胞，引起肌漿網(wǎng)鈣離子釋放，最終導(dǎo)致肌肉收縮。并且，較多的研究表明，細(xì)胞內(nèi)外的鈣例子穩(wěn)態(tài)對于肌細(xì)胞的機能具有重要的影響[6-8]。因此，本課題組擬建立外源性鈣負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞收縮的模型，從另一個角度誘導(dǎo)肌細(xì)胞收縮，為人們能夠更加深刻地認(rèn)識骨骼肌收縮的機能變化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

C2C12小鼠成肌細(xì)胞系購自湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基（Invitrogen，Carlsbad，CA），并加入10%胎牛血清（Sigma-Aldrich， St.louis， MO）和抗生素（100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素）。37℃下置于5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80%時，用0.25%胰酶消化傳代后接種（細(xì)胞密度5 ×l04）于培養(yǎng)瓶或孔板，待細(xì)胞融合至約70%后用于正式實驗。

1.2 實驗分組

根據(jù)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣離子濃度不同（氯化鈣溶液），分為對照組，A組（0uM，不加鈣）和實驗組B組（10uM）、C組（25uM）、D組（50uM）、E組（75uM）和F組（100uM）。每組十個培養(yǎng)瓶。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

項目資助：由湖南省教育廳青年項目（編號：13B025）資助。

1.3 培養(yǎng)液中葡萄糖濃度測定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法。24h前后測定培養(yǎng)液葡萄糖濃度。

1.4 顯微鏡觀察

加入外源性鈣，細(xì)胞收縮反應(yīng)很快，照相時間如下：加鈣之前拍照，固定該細(xì)胞視野不變，加鈣后約5秒左右拍照，此時即可看到細(xì)胞收縮反應(yīng)出現(xiàn)，實驗組加入不同濃度鈣，對照組加入的是蒸餾水，也是參照加鈣的拍照時間，加入蒸餾水5秒后拍照即可，每組均采集1套圖片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Sigmaplot12.3軟件進行分析。實驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間差異采用單因素方差分析。顯著性水平為0.05。

2.結(jié)果與分析

2.1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖濃度（mmol/L）

2.2 顯微鏡觀察

通過實驗得出：A組沒有出現(xiàn)收縮反應(yīng)，B組出現(xiàn)輕度收縮反應(yīng)，C組出現(xiàn)較明顯收縮反應(yīng)，D、E組出現(xiàn)明顯收縮反應(yīng)，F(xiàn)組出現(xiàn)較強收縮反應(yīng)。

3.討論

運動生理學(xué)的主要任務(wù)是探討急性運動對人體的適應(yīng)和慢性運動（訓(xùn)練）對人體的適應(yīng)規(guī)律。作為運動器官，骨骼肌在運動時的機能變化就成為首先要解決的問題之一。但是在整體狀況下，機能功能的改變很難分清是骨骼肌的影響，還是其他器官的作用。因此，骨骼肌細(xì)胞的收縮模型的建立就成為運動人體科學(xué)亟待解決的問題之一。

目前，采用低頻電刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞收縮是最主要的方式[1-5]。本文根據(jù)肌肉收縮觸發(fā)的關(guān)鍵因素是鈣離子和肌鈣蛋白結(jié)合的原理，考慮從鈣負(fù)荷的角度來誘導(dǎo)骨骼肌收縮。下面首先闡述建立該模型的理論考慮和依據(jù)。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)最普通而且重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分之一。靜息狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+約為細(xì)胞外的1/200000。細(xì)胞在激動時，細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+呈雙相升高，其來源為內(nèi)儲的Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流[9]。在體狀態(tài)下，骨骼肌收縮的激發(fā)主要是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，而心肌細(xì)胞的收縮則在很大程度上依賴于胞外Ca2+的內(nèi)流。本課題組采用的外源性鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞收縮雖然和在體狀態(tài)時不太一樣，但是當(dāng)Ca2+和肌鈣蛋白結(jié)合后，后面的機能變化應(yīng)該不會有什么差異。而之所以這么考慮，是因為外源性鈣負(fù)荷比較簡單，而要觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放則比較麻煩，其控制性也較差。

在肌細(xì)胞中，胞外Ca2+內(nèi)流主要依賴電壓依賴性鈣離子通道（Voltage dependent calcium channel， VDCC），目前鈣通道分為6型，骨骼肌細(xì)胞中主要的是L型，其特點是激活后，開放時間長，失活慢。VDCC的激活由諸如環(huán)核苷酸、脂類衍生物或Ca2+本身等介質(zhì)所調(diào)節(jié)，這些介質(zhì)或者使Ca2+通道由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，或者在接受興奮性電刺激后調(diào)整Ca2+通道的活性[10-11]。除了VDCC以外，鈣池耗竭依賴性鈣離子內(nèi)流（store-depletion dependent calcium channel， SDDCC）也是胞外鈣離子內(nèi)流的途徑之一，通常所說的受體介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流屬于這種類型。該通道引起的鈣離子內(nèi)流是通過鈣池耗竭而誘發(fā)的，在質(zhì)膜Ca2+內(nèi)流通道與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耗竭的鈣池間有某種信號聯(lián)系起來。

因此，從理論上來說，外源性鈣負(fù)荷很有可能通過Ca2+本身而觸發(fā)VDCC，從而誘發(fā)培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞收縮。當(dāng)然，這僅是理論上的假設(shè)。本課題組對建立外源性鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞收縮模型的后續(xù)工作之一就是探討外源性鈣負(fù)荷時骨骼肌細(xì)胞的Ca2+信號通道。

本文的研究結(jié)果表明，100uM鈣負(fù)荷時，培養(yǎng)肌細(xì)胞出現(xiàn)較強的收縮反應(yīng)，同時，與對照組相比，24h后，培養(yǎng)液葡萄糖濃度顯著降低。這又從另一個方面證明100uM鈣負(fù)荷確實導(dǎo)致培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞收縮了。因為骨骼肌收縮比安靜時需要更多的能量。因此，綜合顯微鏡觀察和葡萄糖濃度檢測的結(jié)果，本課題組可以確定該模型的建立。遺憾的是，本文沒有檢測此時的鈣離子信號通道的變化情況，這需要下一步的實驗去驗證。

4 結(jié)論

100uM鈣負(fù)荷可以誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞出現(xiàn)較強的收縮反應(yīng)。通過顯微鏡觀察和葡萄糖濃度檢測結(jié)果表明，本文通過外源性鈣負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌收縮模型的建立是成功的。

參考文獻：

[1]THELEN M H， SIMONIDES W S， VAN HARDEVELD C. Electrical stimulation of C2C12 myotubes induces contractions and represses thyroid-hormone-dependent transcription of the fast-type sarcoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase gene[J]. Biochem J， 1997， 321 （ Pt 3）：845-848.

[2] MAROTTA M， BRAGOS R， GOMEZ-FOIX A M. Design and performance of an electrical stimulator for long-term contraction of cultured muscle cells[J]. Biotechniques， 2004， 36（1）：68-73.

[3]TAKAYAMA Y， WAGATSUMA A， HOSHINO T， et al. Simple micropatterning method for enhancing fusion efficiency and responsiveness to electrical stimulation of C2C12 myotubes[J]. Biotechnol Prog， 2015， 31（1）：220-225.

[4]邱國榮， 徐曉陽， 謝敏豪. 電刺激引起C2C12肌管IL-6蛋白及IL-6 GLUT4基因表達的變化[J]. 中國運動醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 31（9）： 806-810.

[5]歐娜， 劉剛， 姜帆， 等. 慢性電刺激對成肌分化的C2C12細(xì)胞肌型轉(zhuǎn)換的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2012， 34（8）： 710-714.

[6]TOTH A， FODOR J， VINCZE J， et al. The Effect of SERCA1b Silencing on the Differentiation and Calcium Homeostasis of C2C12 Skeletal Muscle Cells[J]. PLoS One， 2015， 10（4）：e0123583.

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